目的:沉默调节蛋白(Sirtuin,Sirt)是一类具有多种代谢调节酶活性的蛋白质家族,Sirtuin家族成员共有7个成员(Sirt 1-7),其成员中Sirt 4蛋白和Sirt 5蛋白具有多种酶的活性。近年来研究发现,Sirt 4和Sirt 5广泛参与到细胞生存、衰老和代谢等生物学过程中,在生物体应激反应、炎症反应、肿瘤发生和能量代谢等众多生物学过程中扮演着重要角色,并在癌症、糖尿病、肥胖、帕金森和阿尔兹海默病等疾病的临床治疗方面具有一定潜力。黑色素细胞瘤是临床上比较常见的皮肤肿瘤,目前尚没有关于Sirt 4和Sirt 5在黑色素瘤细胞中表达情况的研究,Sirt 4和Sirt 5调控恶性黑色素肿瘤的发生、发展以及转移机制尚不明确,针对该疾病的治疗还需要更多的探索。本文拟研究Sirt 4和Sirt 5在黑色素瘤中的表达及其功能。研究方法:在黑色素瘤(n=82)和痣(n=18)的组织芯片上,应用免疫组织化学染色技术检测Sirt 4和Sirt 5在其中的表达情况。收集这些患者临床及病理资料,通过统计学分析手段探索临床信息、Sirt 4和Sirt 5的表达情况与黑色素瘤恶性程度的相关性。在37℃,5%CO2饱和湿度的孵箱中,用含10%胎牛血清的M254、DMEM、1640或DMEM/F12等培养基,进行黑色素细胞系PIG1和黑色素瘤细胞系HTB 140、C8161、A2058、2813、435S和A375的培养。应用Western Blot和RT-PCR检测Sirt 4与Sirt 5的表达,筛选出Sirt 4和Sirt 5表达量合适的黑色素瘤细胞系。应用CRISPR/Cas9技术在筛选出的黑色素瘤细胞系以及正常黑色素细胞系中对Sirt 5进行敲除。使用过表达质粒在筛选出的黑色素瘤细胞系以及正常黑色素细胞系中过表达Sirt 5。应用通过划痕试验检测细胞转移能力的变化;通过MTS试验观察细胞增殖能力的变化;通过流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化。结果:Sirt 4蛋白和Sirt 5蛋白在恶性黑色素瘤组织中表达显著高于痣组织。Sirt 5与黑色素瘤的恶性程度呈正相关,但Sirt 4与黑色素瘤的恶性程度没有显著关系。Sirt4 mRNA和Sirt 5 mRNA在恶性黑色素瘤细胞系HTB140、C8161、A2058、2813、A375、435S和1种正常黑色素细胞系PIG1中都存在表达,同样的Sirt 4和Sirt 5蛋白在7个细胞系中都存在表达。通过CRISPR/Cas9技术获得了Sirt 5基因敲除的PIG1、C8161、A375细胞,但是Sirt 5基因敲除细胞系并未使Sirt 5蛋白表达完全消失。Sirt 5过表达质粒成功转入C8161和A375细胞后,应用Western Blot技术检测得知转染Sirt 5过表达质粒的细胞系具有显著的Sirt 5蛋白过表达效果。黑色素瘤细胞的功能学实验中,MTS实验和划痕实验结果表明Sirt 5促进C8161和A375细胞的迁移和增殖。采用流式细胞仪分析显示,过表达Sirt 5在C8161细胞中促进凋亡的同时S期比例增加,并且过表达Sirt 5使A375细胞S期比例增加,但是过表达Sirt 5对A375细胞凋亡没有明显影响。结论:Sirt 4和Sirt 5在黑色素瘤组织中呈阳性表达,在黑色素瘤组织中表达高于痣组织;Sirt 5与黑色素瘤的恶性程度呈显著的正相关,但Sirt 4与黑色素瘤的恶性程度没有显著关系;Sirt 5过表达能够促进黑色素瘤的生长和迁移;同时Sirt 5过表达能促进部分黑色素瘤细胞的凋亡和增殖活性。总而言之,Sirt 5可通过促进黑色素瘤的增殖、凋亡和迁移能力,导致黑色素瘤的进一步恶化。