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研究目的宫颈癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居女性恶性肿瘤的第二位,危害性高。以往大量的流行病学调查显示,宫颈癌发病的主要原因是由于感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)所致。同时也有研究表明,HPVE7引起的细胞周期的重复复制可以促进宫颈癌的发生。然而细胞从感染HPV到癌变所经历的蛋白质表达方面的变化尚未完全阐明,并且HPVE7引起的细胞周期重复复制的具体机制也尚不清楚。另外,近年来发现的一种新型蛋白翻译后修饰-琥珀酰化已经被证实对细胞代谢、生长以及癌变都有很大的作用,因此,我们也想观察这种琥珀酰化修饰在宫颈上皮细胞癌变过程中是否也发挥着重要的作用。本研究一方面选取了HPV永生化细胞系和SiHa细胞系,分别代表感染HPV的细胞和已经癌变的宫颈癌细胞,分析HPV永生化细胞系与SiHa细胞系之间的蛋白质表达差异,探讨从HPV感染到宫颈癌的发生之间的变化；另一方面从与细胞周期复制相关的一些信号通路入手,如Emi1,Cdt1,CDC6, Skp2等,探讨E7所引起的细胞周期重复复制的原理和机制。研究方法一方面,我们用Trypsin将提取出的细胞全蛋白酶解为肽段,之后通过高效液相色谱(HPLC)与质谱(MS)联用技术对蛋白质总数以及一种新型的蛋白质翻译后修饰-琥珀酰化进行鉴定,然后再用一些生物信息学的方法对其进行分析总结,从宏观水平来了解细胞从感染HPV到最终癌变所经历的蛋白质方面的变化。另一方面,我们主要采用在细胞内转染siRNA,之后用Western Blot的方法检测一些与细胞周期相关的蛋白如Emi1, Cdt1, CDC6, Skp2等的表达情况,同时利用流式细胞仪检测细胞周期的变化,最终得出一些相关的结论。结果HPLC与MS联用,总共鉴定到的蛋白总数为10,691个,琥珀酰化修饰位点共6342个。经过非标定量分析之后,共发现572种差异表达蛋白。Western Blot验证结果与非标定量一致。通过进一步的生物信息学分析发现,在HPV永生化细胞系中高表达的273种蛋白多集中在疾病的相关通路,而在宫颈癌细胞系中高表达的299种蛋白多集中在代谢通路和核糖体通路。琥珀酰化修饰总量虽无明显差异,但发现一种可信度较高但未报道过的修饰位点-SGK1 K41琥珀酰化。流式细胞仪所分析的细胞周期结果显示,在用伯来霉素(bleomycin)处理的情况下,E7可以引起非常明显的重复复制；Western Blot结果显示E7能够引起Emi1、Cdt1、CDC6、Skp2的高表达；转染了Emi1 siRNA之后,CDC6和Skp2都有不同程度的下降；在HeLa细胞中转染了Emi1 siRNA后,也可以看到一定程度的重复复制。结论与HPV永生化细胞系相比,SiHa细胞系代谢能力及翻译蛋白能力更强,而HPV永生化细胞中高表达蛋白则大多与疾病相关,且更易发生恶化；HPV永生化细胞和SiHa细胞中新型蛋白质翻译后修饰-琥珀酰化在宏观水平无明显差异,SGK1 K41琥珀酰化很有可能是一种新的蛋白修饰位点；Emi1在E7引起的重复复制中发挥着重要的作用；E7可能是由于影响泛素化通路APC的抑制因子Emi1的表达,进而影响一些与细胞周期相关蛋白如CDC6, Cdt1等的表达,最终导致了细胞发生重复复制。创新性及意义：1.本研究首次从宏观水平将HPV永生化细胞系和SiHa细胞系的全蛋白质进行了比较。2.本研究首次从细胞水平证实了宫颈癌细胞系比单纯感染HPV的细胞系有着更强的代谢活性。3.本研究进一步探讨了HPV E7引起细胞周期重复复制的相关机制,为更好地理解宫颈癌的致病机制奠定了一定的基础。