为什么甲状腺功能亢进(甲亢)的病人全麻手术时,需增加异丙酚的剂量才能达到正常的麻醉效果?这一问题一直困扰临床甲瘤外科与麻醉学领域。本研究通过全细胞膜片钳、细胞内记录、MQAE氯离子荧光探针、免疫荧光和western blot等技术,初步探究了甲状腺激素(TH)及与之相关的P物质(SP)抑制GABA激活电流的机制,为临床麻醉药异丙酚的合理使用及疼痛的治疗提供了相关的理论依据。第一部分：甲状腺激素影响异丙酚麻醉效果的机制目的：为了明确甲亢患者进行手术时,为何麻醉药异丙酚的用药量要明显多于甲状腺功能正常的患者,TH是否通过抑制异丙酚赖以发挥麻醉作用的GABAA受体而影响了麻醉效果。方法：通过给SD大鼠腹腔注射T3 (7μg/100g,每天一次,连续注射14天)制备甲亢大鼠模型。通过免疫荧光技术检测了正常对照组和甲亢组大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元GABAA受体α2亚基和β2亚基的表达。采用全细胞膜片钳检技术,检测了正常对照组大鼠和甲亢组大鼠新鲜分离的DRG神经元GABA激活电流的差异；检测了预灌流甲状腺激素T3 (0.1 μmol/L-100 μmol/L)后GABA激活电流的改变情况及其对异丙酚麻醉效果的影响；以及预灌流GABAA受体阻断剂bicuculline后,T3对异丙酚的抑制作用。结果：1.甲亢大鼠进行麻醉时所需异丙酚剂量明显大于正常对照组。正常对照组为7.14×0.51(mg/100g BW),甲亢组为11.02 × 0.53 (mg/100g BW)。2.甲亢组大鼠DRG神经元GABAA受体α2亚基和β2亚基的表达以及GABA激活电流的大小与对照组相比,均无统计学差异；甲亢大鼠热缩足潜伏期与对照组相比没有差异。3.T3可以抑制DRG神经元GABA激活的内向电流。10 μmol/L的T3可以抑制DRG神经元的GABA(100 μmol/L)激活电流,预灌流不同浓度的T3(0.1-100μmol/L)后发现,T3对GABA所激活内向电流的抑制作用呈浓度依赖性,即T3的浓度越高,其对GABA激活电流的抑制作用越强。单独给予T3(0.1-100 μmol/L)不能引起任何内向电流或者外向电流。4.T3可以抑制异丙酚增强后的GABA激活电流。T3预灌流正常SD大鼠DRG神经元结果显示：(1)预灌流5 μmol/L的异丙酚,再给予100 μmol/L的GABA,记录到一个增大的内向电流,标准化的电流大小为2.21±0.36； (2)预灌流10 μmol/L T3和5 μmol/L异丙酚的混合物后,给予100 μmol/L GABA,记录的激活电流变小,标准化电流大小为1.24±0.21。5.T3对异丙酚麻醉效果的抑制作用可以通过增加异丙酚的浓度弥补。实验中,增加异丙酚的浓度,10 μmol/L T3和10 μmol/L异丙酚的混合预灌流,然后给予100 μmol/L GABA,记录到GABA激活的内向电流幅度比灌流5 μmol/L的异丙酚时显著增加了,标准化电流大小为2.10±0.31,这个结果提示增加异丙酚的浓度可以部分抵消T3对异丙酚增强GABA激活电流的抑制作用。6. GABAA受体阻断剂bicuculline可以阻断异丙酚对GABA增强后的激活电流。预灌流100 μmol/L的bicuculline可以阻断GABA (100 μmol/L)激活的内向电流;同样bicuculline也可以阻断T3 (10 μmol/L)抑制后的GABA激活电流；同时,bicuculline还可以阻断异丙酚(5 μmol/L)对GABA增强后的激活电流。7.整合素αvβ3特异性的阻断剂tetrac不能阻断T3对GABA激活内向电流的抑制作用。结论：T3对异丙酚麻醉效果的抑制作用是通过甲状腺激素的瞬时作用途径抑制GABAA受体的功能实现的。这种抑制效果可以通过增加异丙酚的浓度而减弱。第二部分：甲状腺激素抑制GABA激活电流的机制目的：GABA能系统是甲状腺激素调节的重要靶点,目前研究证实TH的非基因作用途径(瞬时作用途径)可以通过抑制GABAA受体的功能来抑制GABA的激活电流,但机制尚未明了。由于GABA激活电流是由胞内C1-跨膜流动所引起,故神经元内Cl-浓度的变化可以直接影响GABA激活电流的大小,本研究探讨了TH对GABA激活电流的抑制作用是否由Cl-浓度的变化和氯离子转运体表达的变化所致。方法：采用成年SD大鼠新鲜分离的DRG神经元和大脑皮层神经元,全细胞膜片钳检测三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine, T3,10 μmol/L)预灌流前后GAB A (10 μmol/L)激活电流的大小。用MQAE (N-Ethoxycarbonylmethyl-6-methoxyquinolinium bromide)氯离子荧光探针检测T3 (10μmol/L)孵育前后DRG神经元和大脑皮层神经元内氯离子浓度的变化情况。用腹腔注射T3的方法建立甲状腺功能亢进大鼠模型,分别检测T3 (7μg/100g体重,每天1次)连续注射3d、7d和14d后(连续注射14d可以建成甲亢模型)DRG和大脑皮层内钠钾氯共转运体(Na+-K+-2C1- transporters, NKCC1)和钾氯共转运体(K+-C1-transporters, KCC2)的表达。结果：1.T3可以抑制DRG神经元GABA激活的内向电流。10 μmol/L的T3可以明显抑制SD大鼠DRG神经元的GABA激活的内向电流,抑制百分率为41.2%±5.1%。2.T3不改变DRG神经元和皮层神经元内的氯离子浓度。T3 (10 μmol/L)孵育前后(孵育前1 min和孵育后1,3,5,7,9min) DRG神经元和大脑皮层神经元内氯离子浓度没有统计学差异(MQAE氯离子荧光探针法)。3. 甲亢大鼠DRG神经元和大脑皮层神经元内氯离子浓度与正常大鼠相比无统计学差异。4.甲亢大鼠DRG和大脑皮层NKCC1和KCC2的表达量与正常对照相比无统计学差异。T3(7μg/100g体重,每天1次)腹腔连续注射3d、7d和14d后,大鼠DRG内NKCC1的表达量和大脑皮层内KCC2的表达量与正常对照相比均无统计学差异。结论：甲状腺激素对DRG神经元GABA激活内向电流的抑制作用,不是由于神经元内C1-离子浓度的变化和氯离子转运体表达的变化所致。第三部分：P物质抑制GABA激活电流的相关机制目的：在DRG神经元上,揭示SP对GABA激活电流的调节机制,以进一步明确DRG调节外周伤害性信息传入的机制。方法：选用8-10周龄SD大鼠,雌雄不拘,体重250～280 g,直接断头处死。取出胸腰段DRG,迅速置于DMEM液中(pH=7.4)。剪碎后置于消化酶中消化30 min(胰蛋白酶0.25 mg/mL;胶原酶0.5 mg/mL)。然后将神经元转置35mm培养皿中静置30min以上。在大鼠DRG神经元上采用全细胞膜片钳和细胞内记录技术记录GABA激活电流。结果：1. GABA可以诱发大多数DRG神经元产生内向电流。给予GABA (1～1000 μmol/L)可以诱发大部分DRG神经元(114/127,89.8%)产生浓度依赖性的内向电流。GABAA受体特异性的激动剂muscimol(100μmol/L,n=11)可以模拟GABA的激活电流。GABA和muscimol的激活电流均可以被GABAA受体特异性的阻断剂bicuculline所完全阻断(100μmol/L)。说明该电流由GABAA受体介导。2.NK1受体阻断剂可以阻断SP对GABA激活电流的抑制作用。预灌流SP (0.001～1 μmol/L)后再给予GABA,全细胞膜片钳检测到GABA的激活电流被抑制。NK1受体阻断剂spantide (40 μmol/L, n=7)可以阻断SP对GABA激活电流的抑制作用,但是NK2受体阻断剂L659187(20μmol/L,n=7)和NK3受体阻断剂SR142801 (20μmol/L, n=7)不能阻断SP对GABA激活电流的抑制作用。Spantid (5、20和40μmol/L)的抑制效果呈浓度依赖性,但是L659187(1、10和20μmol/L)和SR142801(1、10和20 μnmol/L)则没有任何效果。3.NK1受体阻断剂可阻断SP抑制GABA诱发的膜去极化反应。用细胞内记录技术记录了DRG 257个神经元,在所记录的神经元中给予GABA (1～1000 μmol/L)可以诱发去极化反应的有236个(236/257,91.8%)。用100μmol/L的GABA所诱发膜去极化反应的平均幅度为12.3±3.6 mV(n=7)。预灌流SP (0.001～1 μmol/L)可以抑制GABA诱发的膜去极化反应。与膜片钳检测结果相一致,SP (0.1 μmol/L)对GABA诱导去极化反应的抑制作用可以被NK1受体阻断剂spantide所阻断。4.磷脂酶C和蛋白激酶C参与了SP抑制GABA激活电流。磷脂酶C (phospholipase C, PLC)的抑制剂U73122 (1μmol/L,n=6)和蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)的抑制剂chelerythrine (1 μmol/L, n=9)均可以阻断SP对GABA激活电流的抑制作用,但是蛋白激酶A (protein kinase A,PKA)的抑制剂H-89 (1μmol/L,n=8)对SP的这种作用没有效果。U73122和chelerythrine的抑制效果均呈浓度依赖性。5. PKGε亦参与了SP抑制GABA激活电流。PKCε特异性的阻断剂epilon V1-2 (10μmol/L)可以阻断SP对GABA激活电流的抑制作用,但是PKCα特异性的阻断剂safingol (10μmol/L)和PKCβ特异性的阻断剂LY333531 (10nmol/L)不能阻断SP的这种作用。结论：SP通过激活神经元细胞膜上的NK1受体,经细胞内G蛋白-PLC-PKCε途径磷酸化GABAA受体,从而抑制GABA激活该受体的内向电流。SP可能正是通过抑制GABA介导的突触前抑制参与调节外周伤害性信息的传入。全文结论：1.甲亢手术病人全身麻醉时所需全麻药异丙酚的量增加是由于甲状腺激素抑制了异丙酚对GABA激活电流的增强作用所致。2.甲状腺激素对GABA激活电流的抑制作用是通过抑制GABAA受体的功能实现的。在此过程中,神经元细胞膜上的氯离子转运体(NKCCl和KCC2)的表达和功能以及细胞内的氯离子浓度均没有发生变化。3.SP对GABA激活电流的抑制作用是通过激活其自身受体NK1,从而启动PLC,最终激活PKCE,磷酸化GABAA受体而抑制该受体的功能。