论文部分内容阅读
特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种慢性、炎症性皮肤疾病,常反复发作,缠绵难愈,且发病率逐年上升,已经严重危害着人类的健康。目前AD的发病机制尚不明确,治疗存在着一定的局限性。中医药治疗AD有着悠久的历史和丰富的临床经验。西苑医院黄尧洲教授从心论治AD,创立的龙牡汤,对于特应性皮炎有较好的临床疗效。故本研究通过建立AD模型小鼠,给予龙牡汤灌胃干预,以观察其疗效,通过免疫学指标的变化,探求其可能的治疗机制。目的1.探索AD模型小鼠的制备方法及模型评价。2.龙牡汤治疗AD模型小鼠的疗效观察。3.探索龙牡汤治疗AD模型小鼠的免疫调节作用机制。方法一、AD模型小鼠的制备方法与模型评价1.参考国内外文献关于AD样模型小鼠的造模方法,综合各方面考虑分析,选用DNCB外源性刺激BALB/c小鼠。购买12只6周龄雄性BLAB/c小鼠,随机分为模型组和对照组,每组6只。2.造模方法:第1周,模型组采用1%浓度的DNCB溶液,使用微量移液器与毛刷配合均匀涂抹在小鼠背部及右耳,每次50ul;对照组采用丙酮橄榄油混合液(1:4)外涂,涂抹方法同模型组。每日一次,连续涂抹2天,间隔4天,从第7天开始,模型组改为0.2%浓度的DNCB溶液,对照组同前。以后每隔一天,涂抹一次。造模时间共计3周,反复涂抹共计10次。3.分别于不同时点(第1、7、13、21天,涂抹试剂1h后),观测两组小鼠的临床症状(搔抓次数、皮损状况,耳廓肿胀度),于第21天外涂溶液刺激后,24h内摘眼球取血送检,并留取局部皮损病理送检,综合临床症状、皮肤病理学改变以及血清学炎症因子的变化,评价模型是否制备成功。二、龙牡汤治疗AD样模型小鼠的疗效观察1.另行购买18只6周龄BALB/c小鼠,随机分为3组(中药组、模型组、空白组),每组6只。将模型组和中药组用上述造模方法,制备AD模型小鼠,空白组则给予丙酮橄榄油外涂,方法同前。3周造模结束后,中药组给予龙牡汤灌胃,而模型组、空白组均给予0.9%NS灌胃,再经过3周干预期,通过指标观测,对比三组小鼠的差异,以评价龙牡汤治疗AD小鼠模型的临床疗效。2.用小鼠血清ELISA试剂盒检测三组小鼠(中药组、模型组、空白组)血清学指标(IL-4、IgE、IFN-y)的表达情况,采用LSD统计学方法,分析龙牡汤对血清中炎症因子指标的影响。3.综合AD的临床特点及免疫学表现,选取搔抓次数、皮损评分、耳廓肿胀度以等宏观方面观察,结合小鼠背部皮损组织病理学变化和外周血清学炎症因子的变化,综合评价龙牡汤的疗效。三、龙牡汤治疗AD模型小鼠的免疫学机制1.药物干预结束后,取模型组和中药组共计12只小鼠背部的皮肤,经过SP免疫组化染色,统计小鼠皮损中TLR4和NF-κBp65的蛋白共表达结果,采用Spearman相关分析,分析TLR4和NF-κB p65的相关性。2.将3组小鼠的背部皮损组织中的TLR4和NF-κB p65的蛋白表达进行统计,所得数据做免疫组织化学染色阳性信号累积光密度(IOD),以IOD值作为组织表达的定量标准,再结合三组小鼠的血清学检测中炎症因子(IL-4、IgE、IFN-γ)的表达,通过偏相关性分析,探讨龙牡汤治疗AD模型小鼠的免疫调节作用机理。结果一、AD模型小鼠的制备与评价1.与对照组比较,AD模型组小鼠的背部皮损病理表现为:角化过度伴角化不全,棘层肥厚,表皮层、真皮层可见明显的炎性细胞浸润,毛细血管扩张。2.与对照组相比,AD模型组小鼠的血清学中IgE、IL-4含量均明显升高(P<0.01),而IFN-γ的含量无明显变化(P>0.05)。3.造模结束后,与对照组比较,模型组小鼠的临床症状(搔抓次数、耳廓肿胀度和背部皮损评分)均明显升高,其差异有统计学意义(P<0.05)。且模型组小鼠的临床症状严重程度随着造模时间的延长而显著增加(P<0.01)。二、龙牡汤治疗AD模型小鼠的疗效观察1.3周灌胃干预后,中药组小鼠的搔抓次数、耳廓肿胀度以及皮损严重程度评分均低于模型组小鼠,差异分析有统计学意义(P<0.05),但较空白组小鼠仍高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.3周干预后,与空白组相比,模型组和试验组小鼠血清IgE、IL-4的含量均高,差异有统计学意义(P<0.01)。试验组跟模型组相比较,IgE、IL-4的含量有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。三组血清IFN-γ相互比较,差异无统计学意义(P>0.05)。三、探索龙牡汤治疗AD模型小鼠的免疫学机制1.通过LSD统计学分析:TLR4、NF-κBp65在三组中表达均有差异(P<0.05),其中模型组最高,中药组其次,空白组最小。2.将AD模型小鼠皮损中TLR4和NF-κB p65蛋白共表达结果进行Spearman相关分析,发现TLR4和NF-κBp65的表达呈正相关(r=0.618,P=0.02<0.05)。3.将血清学炎症因子指标(IL-4、IgE、IFN-γ)与TLR4/NF-κBp65通路相关性分析,结果统计分析:IL-4与TLR4、NF-KBp65呈正相关,相关系数分别是:0.485、0.569(P<0.05);IgE 与 TLR4、NF-κBp65 呈正相关,相关系数分别是:0.651、0.721(P<0.05);IFN-γ 与 TLR4、NF-κB p65 呈正相关,相关系数分别是:0.55、0.634(P<0.05)。结论1.通过DNCB外源性诱导刺激BALB/c小鼠,可成功制备AD模型小鼠。2.龙牡汤治疗AD模型小鼠有效,可以从临床症状和血清学以及皮肤病理学等方面改善。3.龙牡汤有可能是通过影响TLR4进而阻断NF-κB p65通路释放炎症因子,从而平衡Th1/Th2细胞亚群而发挥免疫调节作用。