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本研究采用合成生物学方法构建了初始大肠杆菌异丁醇合成菌株,并以代谢网络模型和代谢组学方法,依次理性解决菌株的还原力平衡和残糖转化问题,最终获得高效“环保型”异丁醇合成菌株,使残糖浓度基本上等于0 g/L。首先构建了初始异丁醇合成菌株LA02,以36 g/L葡萄糖为底物,异丁醇产量为2.7 g/L。针对异丁醇合成产量不足,从还原力代谢角度出发,建立基因组尺度网络模型,联合代谢通量平衡分析和最小代谢调节分析方法,预测得出糖酵解途径中由甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应,是异丁醇合成还原力调节的关键代谢途径。以此指导构建了异源gapN通路,并采用不同强度的人工组成型启动子调节该通路,获得了最佳异丁醇合成菌株LA09,其胞内NADPH/NADP比值在对数生长期和稳定生长期分别提高到0.67和0.64,使得异丁醇产量得以提高了2.21倍至8.68 g/L。然而发酵完毕后,仍有1.36 g/L残糖存在。针对以上残糖问题,继续开展“环保型”异丁醇合成菌株构建,使残糖浓度基本上等于0 g/L。以菌株LA09为研究对象,开展20~80 g/L初始糖浓度下的分批发酵,由于高浓度糖抑制作用,40 g/L是最佳的初始糖浓度。然后采用气质/液质联用检测胞内代谢变化,通过主成成分和层聚类分析计算得出了15个标志性代谢物,分别与辅因子、糖酵解代谢和渗透压的应激性相关。通过比较分析表明糖酵解途径中6磷酸果糖激酶催化的代谢反应上游的代谢物水平倍增(1.91~2.68)远远大于该代谢反应下游的代谢物水平倍增(1.16~1.36),因此确定6磷酸果糖激酶催化的代谢反应是异丁醇合成菌株糖转化的关键限速途径。针对该限制步骤,理性设计和构建了异源人工ED糖代谢途径,并以人工启动子对ED上下游途径进行表达调节,降低有毒中间代谢物2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸抑制作用,获得了最佳“环保型”异丁醇合成菌株E.coli ED02。E.coli ED02在40 g/L初始糖浓度下进行发酵,残糖浓度基本上降低到0 g/L,葡萄糖平均吸收速率比E.coli LA09提升了19.8%达到1.33 g/L/h,发酵时间大大缩短至30 h以内。E.coli ED02的异丁醇产量达到13.67 g/L,比对照菌株E.coli Control1(9.30 g/L)和E.coli LA09(8.74 g/L)分别提升了47%和56%。