论文部分内容阅读
茶皂素（Tea saponins,TS）是一类从茶籽粕中提取出的副产物,主要以配基、糖体和有机酸组成其基本骨架,组成方式的多样性赋予了TS丰富的生物活性,如溶血性、抗炎活性、抑菌性、保肝护胃、影响酒精代谢等。近些年研究者开始集中于分离提取茶皂素中的活性组分,因茶皂素组成的复杂性,活性单体的分离仍为研究的难点。磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles,MNP）因其具有出色的磁响应性和高生物相容性等特点而被应用于各大领域。在食品相关的应用中,其常被用于酶的固定化、蛋白质纯化和食品分析。利用磁性载体固定化酶,不仅能提高酶的稳定性,更能提高酶的回收利用率。本研究通过将与酒精代谢直接相关的乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）固定化于氨基功能化的磁性纳米粒子上,制备磁性固定化酶（magnetic immobilized ADH,MIADH）,以MIADH作为工具靶向分离TS中的ADH活性组分（ADH-related active ingredients,AAI）,同时构建体外解酒模型,对AAI影响酒精代谢的机理进行了探究,为磁性靶向分离技术和茶皂素的应用开发提供了理论基础和相关技术支持。主要研究结果如下:1.采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子,通过单因素试验对其制备条件进行优化,建立了磁性纳米粒子的快速合成法并得到了尺寸合适、性能良好的复合磁性纳米粒子。结果显示,以FeSO4与Fe Cl3作为反应底物,反应温度60℃,反应时间30 min的条件下,制得的粒子粒径分布均匀,经透射电镜和扫描电镜表征结果综合验证,粒径大小控制在90～100 nm之间,饱和磁化强度为80.2 emu/g,具有超顺磁性,性能好;X射线衍射结果表明制备的Fe3O4符合尖晶石型的四氧化三铁晶面。对获得的Fe3O4进行表面Si O2的包覆以及氨基功能化修饰,修饰后的粒子在水溶液中分散更为均匀,经电镜表征得知,粒子经修饰后仍呈圆球形,Si O2外层的厚度约为16 nm,能谱仪扫描结果证明其表面成功接枝上氨基。由VSM曲线得知,由于修饰后硅层致密均匀,致使饱和磁化强度有所降低,但氨基功能化修饰前后粒子仍具有很好地磁响应性。2.利用复合磁性纳米粒子为载体对ADH进行磁性固定化研究,采用热重分析、红外光谱、磁响应曲线等对MIADH进行表征,并对其性质进行分析。结果显示,FT-IR图谱中出现固定化酶中所含有的-CO-NH-特征峰,得知ADH成功地固定化到了功能化磁性纳米粒子上,成功制得MIADH,且该结论通过热重分析结果得到证实,其饱和磁化值为21.6 emu/g,仍具良好的磁响应性。当ADH初始浓度为50μg/mL,固定化交联时间2.5 h,交联剂浓度5%时,能得到最优的MIADH,其酶活保留率为73.13%;ADH经固定化后显著提高了其储藏稳定性和复用稳定性,在4℃的储藏环境储藏至第4天,MIADH的相对酶活高于游离ADH的酶活10倍;MIADH使用至第15次仍具有超过70%的最初酶活,表现出较强的复用稳定性。磁性固定化后的MIADH酶活保留率较高,能够实现ADH的快速磁性分离和循环再利用。3.对TS进行纯化研究,并利用MIADH磁性分离了TS中的AAI。通过两级沉淀法对TS进行提纯,经紫外光谱和傅里叶红外光谱分析可得,提纯前后均在270 nm附近有紫外吸收峰,提纯后,1047.15cm-1和1049.36 cm-1处的红外透过率增强。利用MIADH磁性靶向分离出AAI,通过UPLC-QTOF-MS检测并对比数据库和参考文献可知,AAI中包含TS类化合物和非TS类化合物。根据离子碎片和参考文献推断,能够已知结构的活性物质包括以下三种:Oleiferasaponin A1(C59H92O26)、Camelliasaponin B1(C58H90O26)和Theasaponin A2(C59H92O27),该三者与乙醇吸收相关的生物活性已有报道,推测为经MIADH磁性分离的AAI中主要成分。4.构建体外解酒细胞模型,从生理生化指标和基因表达方面对AAI的护肝特性及解酒机理进行了探究。结果显示,在L02和Hep G2细胞中,AAI能减少乙醇所致的肝细胞毒性和凋亡,能降低AST和ALT的分泌,减少LDH和MDA的生成与泄露,提高GSH和SOD活性,同时能促进ADH和ALDH的酶活性,且均呈浓度依赖性。进一步通过RT-PCR结果可知,AAI对L02细胞和Hep G2细胞作用机理不同,其对相关基因的表达影响截然相反:于L02细胞而言,高剂量（10μg/mL）的AAI上调了ADH1B、ALDH2和CYP2E1的表达,炎症相关因子IL-6和TNF-α由低剂量（5μg/mL）AAI抑制,而于Hep G2细胞而言,ADH1B、ALDH2和CYP2E1的表达由低剂量的AAI促进,炎症相关因子则需高剂量进行干预。这说明AAI的确能减轻肝细胞中炎症反应,调控解酒相关基因表达,减缓肝损伤的发病进程。5.基于AAI的理化特性,考察了AAI的添加对海绵蛋糕的品质影响,结合AAI的起泡性及护肝特性与海绵蛋糕质地柔软细腻的特点,研发制作了一种包含AAI的海绵蛋糕。综合蛋糕成品的理化性质及感官特性,证明AAI的添加对海绵蛋糕的性质起到了改善作用。蛋糕体具有细腻均匀的内部结构,风味适宜。当AAI添加量为1‰时,海绵蛋糕不仅具有较为明亮的色泽,且其防腐效果最好,能在不添加其他防腐剂的条件下保持最长的货架期。