临床上因外伤,先天性畸形,肿瘤切除术后以及老年化等各种原因引起的软组织缺损一直是整形外科所面临的难题,这一类缺损不仅影响患者的美观,而且对患者的心理健康也造成影响,严重者甚至损害机体功能。目前临床上主要采取皮瓣移植,自体或异体组织移植等方法进行填充,取得了一定成效,但这类外科手术方法有着明显的不足,如供区畸形,免疫排斥反应,炎症反应,以及逐渐被机体吸收等。因此,开发出一种理想的软组织替代物在临床上有着巨大的需求。近年来,可注射式填充剂被用来做为软组织替代物已经在临床上广泛应用,其微创、能适应各种复杂形状缺损的特性使得这类材料更加容易被医生和患者所接受。目前这类产品已经市场化,主要有胶原蛋白,透明质酸钠等可降解材料,以及羟基磷灰石,聚甲基丙烯酸甲酯等不可降解材料。然而这类产品仅仅起到一个填充作用,并且会逐渐被机体所吸收,部分不可降解产品甚至会出现严重的并发症,如炎症反应,局部异物肉芽肿等。利用组织工程原理以及注射式可降解生物材料,如胶原,明胶,纤维蛋白原,海藻酸钠,蚕丝蛋白等,则为软组织缺损修复提供了一个新思路。这些天然的可注射式生物材料在注入体内后通过物理或者化学交联的方法都可形成水凝胶状的物质,并且这些材料具有较好的生物相容性,生物可降解性以及能为种子细胞提供良好的空间生存环境。然而,这些利用可注射生物材料所形成的组织工程组织长期面临的一个难题是血管化不足导致局部坏死以及注射后移植物容积减少。这也是如何再生大体积的可用于临床的软组织所长期面临的一个难题,因此,充分的血管化对组织工程组织的存活起着至关重要的作用。目前已报导的诱导软组织工程血管化的方法有多种。例如,为了再生出血管化的软组织,有学者将人脂肪组织来源的间充质干细胞与血管内皮细胞共同培养,取得了一定的效果。但是从临床应用的角度来讲,通过缓释具有促血管生成能力的生长因子来再生出血管化的软组织,如血管内皮生长因子(VEGF),成纤维细胞生长因子2(FGF-2),比起共培养细胞的方法则显得更加简单易行,并且从经济成本上来说更为划算。为此,一些学者将含有大量促血管生成因子的脂肪组织提取物与玻尿酸类的水凝胶混合,通过一系列体外及体内试验表明,这种复合物具有较强的促进血管化的作用。但是在这种方法中,含有大量生长因子的脂肪组织提取物与可注射玻尿酸仅仅是通过简单的混合,从这种复合物中所释放出的生长因子无论是时间上还是空间上都无法得到控制。大量研究表明,这些具有促血管化效果的生长因子只有在释放出足够量以及足够长时间的条件下,才会诱导再生出功能化的血管网络。相比之下,通过将包裹有fgf-2的明胶微球与胶原蛋白类的可注射材料相混合,对生长因子的缓释起到了更好的调控作用,这种调控更加有利于再生出血管化的软组织。但如何改善胶原蛋白类凝胶的机械特性,使其能够对新生的软组织结构进行更好的支撑,至今仍然未被很好的解决。因此,开发出一种新的能够控释促血管化生长因子的可注射生物材料用于软组织再生是非常必要的。目的:构建一种具有良好可控性的可注射式水凝胶缓释体系,评价这种水凝胶与血管内皮生长因子混合后的快速促血管化效果,评价其在可注射式软组织工程中的作用,为组织工程促血管化提供新的思路。方法:首先,本研究通过两步合成反应,将酪胺和肝素依次连接在明胶的主链上,形成明胶/酪胺/肝素复合物,这种复合物的水溶液在过氧化氢(h2o2)以及辣根过氧化物酶(hrp)的催化下,可原位形成水凝胶。通过对样品的红外光谱分析、肝素及游离氨基浓度的检测,证实肝素和酪胺被成功的接合在明胶主链上。随后通过改变催化物浓度以及聚合物浓度的方法,检测相关凝胶特性,如凝胶时间,凝胶强度以及降解速率,验证这种可注射式水凝胶的可控性。通过bca法检测水凝胶对bsa的释放以及elisa法检测水凝胶对vegf的释放,评价这种可注射式水凝胶的缓释能力。为了进一步验证这种具有缓释效果的水凝胶的促血管化效果,首先,体外实验建立了细胞划痕实验模型,观察不同时间段的释放液对人脐静脉血管内皮细胞的移行能力的影响,随后,建立了鸡胚绒毛尿囊膜实验模型,采用更直接的方法验证这一可注射式明胶/酪胺/肝素水凝胶复合vegf的快速促血管化效果,最后,将复合有vegf的明胶/酪胺/肝素水凝胶注射于c57bl/6小鼠皮下,进一步表征这种水凝胶支架对血管化及诱导再生的影响,采用大体观察、组织病理技术、免疫组化等方法对新生血管及组织反应性进行了评价。结果:1.通过tnbs试剂盒对明胶和反应后的g/t中的游离氨基进行定量检测,结果发现g/t中-nh2含量与明胶中-nh2含量相似,而g/t/h组中游离氨基的数量与g/t相比明显减少,说明-nh2被大量消耗,同时也表明肝素被成功的接合在g/t上。2.当聚合物g/t/h浓度固定时,凝胶时间随着hrp浓度升高而不断缩短,随着h2o2浓度升高而不断延长;而当hrp浓度固定时,凝胶时间随着聚合物浓度升高而不断缩短,随着h2o2浓度升高而不断延长;当hrp浓度为1unit/ml,h2o2浓度为0.75mm时,随着聚合物浓度不断增加,凝胶时间逐渐缩短。3.当g/t/h浓度为5%,hrp浓度为1unit/ml时,随着h2o2浓度不断升高(<5mm),凝胶强度也随之不断升高,而当h2o2浓度继续升高时(>5mm),凝胶强度则逐渐减弱。4.低浓度水凝胶的降解速率要明显快于高浓度的水凝胶;当h2o2从较低浓度逐渐上升到5mm时,水凝胶的降解速率逐渐减慢,而随着h2o2浓度继续上升(>5mm),水凝胶的降解速率反而加快。5.无论是g/t/h水凝胶还是g/t水凝胶,都表现出一种双相性的释放过程,即vegf在早期会有一定的突释现象,随后进入一个缓慢和持续的释放过程。但不同的是,vegf在g/t/h水凝胶中的突释量明显低于g/t水凝胶。6.通过对细胞移行的数目及距离测量发现,空白对照组细胞移行数目及平均移行距离,均明显短于实验组,此外,所有实验组细胞的移行数目与移行距离均与vegf(10ng)组类似(p>0.05),表明经过4周的释放,从g/t/h中所释放出来的vegf仍然保持了较高的活性。7.鸡胚绒毛尿囊膜实验发现,对照组凝胶周围血管生长情况与正常鸡胚一样,血管呈随机生长,无明显趋向性,而加有vegf的实验组,水凝胶周围形成了明显的血管网络,新生的血管以水凝胶为中心呈辐射状排列,g/t/h组最为明显,通过对血管定量研究发现,对照组周围血管平均数量为18±3,实验组水凝胶周围血管数量明显高于对照组(p<0.05),此外g/t/h组水凝胶周围血管数量(42±4)明显高于g/t组水凝胶(30±6)(p<0.05)。8.缓释vegf的明胶/酪胺/肝素水凝胶注射于小鼠皮下后发现,g/t/h+vegf组凝胶周围有明显的血管生成,并且这些血管与小鼠自身血管系统区别明显,凝胶表面可见大量弯曲、密集、多分支的血管,并且这些血管有长入凝胶内部的趋势。组织学he染色以及免疫组化染色发现,g/t组水凝胶仅在凝胶表面有少量细胞浸润,边缘处发现少许血管,而g/t/h+vegf组无论是从细胞浸润深度,还是从新生血管数目以及血管分布范围来讲,都明显高于其他组,这种水凝胶所再生出的血管几乎占据了整个水凝胶内部。有趣的是虽然g/t/h组没有加入vegf,但是组织学检测发现这种水凝胶内部也发现了明显的细胞浸润和血管再生。结论:1.这种可注射式水凝胶具有良好的可控性,其机械特性(如凝胶时间,凝胶强度,降解速率)可通过改变催化物及聚合物的浓度得以控制;2.体内、体外实验表明这种肝素改性的水凝胶不仅能够缓释VEGF,还能够在较长的时间内保持VEGF的活性,具有较强的促血管化效果;3.尽管没有VEGF的掺入,这种肝素改性过的水凝胶仍然具有一定的促血管化能力;