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滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)为延龄草科(Trilliaceae)重楼属(Paris)多年生草本，是云南白药等大型药厂的重要原料。目前云南的滇重楼野生资源因过度采挖而被列入濒危天然药物，加上种源混杂、品质良莠不齐、生长速度慢等问题，远不能满足医药市场的需求。因此筛选优良种源，研究滇重楼皂苷累积规律，鉴别皂苷合成的相关基因，通过基因调控提高滇重楼皂苷含量，对促进滇重楼产业发展、保护滇重楼野生资源、增加山区农林经济收入及促进农林生态系统的良性循环等经济和生态效益方面均具有重要意义。
本研究收集了云南普洱景东、玉溪澄江、大理剑川、丽江永胜、楚雄大姚、文山丘北、曲靖马龙、昭通镇雄等8个地理种源的滇重楼，筛选出了总皂苷含量最高且生长速度较快的普洱景东种源作为生产和研究对象。通过测定其重楼皂苷含量，研究了不同组织器官、不同季节、不同地理种源滇重楼皂苷差异;在其含量最低、最高季节对其不同组织器官采样进行转录组测序，比对筛选出参与皂苷合成的关键候选基因，随机对其中20个基因进行了荧光定量PCR检测，并与皂苷含量进行相关性分析;克隆关键基因并用生物信息学的方法对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白结构及功能的预测分析。主要研究结果如下:
(1)普洱景东种源的滇重楼皂苷含量最高，含量高达1.57％;其根茎生长速度较快，根茎生物量年增长率为17.76％;生长期为10个月，为优质滇重楼种源，应大力发展。
(2)普洱景东种源滇重楼1.5a龄段的根茎、叶片、须根、茎、叶、花、芽、果皮和种子等部位均检测到重楼皂苷，含量从高到低排列为:根茎＞叶＞种子＞芽＞茎＞须根＞果皮＞花。除根茎外的其他部位的皂苷含量均未超过0.6％，但整个植株仍然具有开发利用价值，尤其是茎叶中总皂苷含量达0.16.0.52％，建议提取利用。根茎1.5a龄段中皂苷含量从高到低排序为:2a龄段＞3a龄段＞4a龄段、5a龄段＞1a龄段，其中根茎2a龄段中重楼总皂苷含量最高，1a龄段含量最低。
(3)普洱景东种源的滇重楼皂苷含量年周期规律如下:在休眠期1月份左右皂苷含量最高，在花果期皂苷含量最低，在根茎快速生长期含量适中。
(4)通过对普洱景东种源滇重楼8个样品的转录组测序，共获得69.84Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到6.15Gb，Q30碱基百分比在85.63％及以上。组装共得到79，867条Unigene，Unigene的N50为1,361，组装完整性较高;最终获得41，253个有注释信息的Unigene;其中KEGG的Unigene有14769条差异基因。对8份样品的转录组数据进行比较分析，共有23，816条差异基因，其中有13，183个Unigene上调表达，10,633个Unigene下调表达。
(5)通过分析滇重楼转录组基因功能注释数据，筛选重楼皂苷合成的相关基因，分别涉及甾体皂苷合成的上、中、下游通路。MVA通路中，共注释6个合成酶涉及到30条Unigene;MEP通路中，注释到7个合成酶涉及10条Unigene;一系列参与甾体骨架合成的候选基因，涉及6个合成酶18条Unigene;包括甾体皂苷元前体固醇的生物合成和甾体皂苷元的氧化和修饰过程的下游通路，涉及3类合成酶的221条Unigene;通过对滇重楼转录组数椐中Unigene功能注释分析，在与甾体皂苷生物合成相关的次生代谢通路中找到272条涉及22条代谢通路的Unigene，包括:AACr[EC:2.3.1.9]、∥β[EC:5.4.99.39]、CAS[EC:5.4.99.8]、SE[EC:I.14.99.7]、SQS[EC:2.5.1.21]、FPPS[EC:2.5.1.10]、GPPS[EC:2.5.1.29]、IPPI[EC:5.3.3.2]、HDR[EC:1.17.1.2]、HDS[EC:1.17.7.1]、MDS[EC:4.6.1.12]、CMK[EC2.7.1.148]、MCZ[EC:2.7.7.60]、DXR[EC:1.1.1.267]、DXS[EC:2.2.1.7]、PMD[EC:4.1.1.33]、PMK[EC:2.7.4.2]、MVK[EC:2.7.1.36]、HMGR[EC:1.1.1.34]、HMGS[EC:2.3.3.10]、UCrs[EC:2.4.1.173]、CYPs[EC:1.14.13.21]等，几乎覆盖了甾体皂苷合成通路中的所有节点，丰富了滇重楼皂苷载体生物合成通路酶基因信启、，有助于我们更好的了解滇重楼甾体皂苷合成通路。
(6)通过对滇重楼皂苷合成的K000100通路中各样本的差异基因比较发现:类固醇合成通路中下列基因在各组织样本间差异表达:FDFTl、ERG6、SMTl、SMT2、SM02，DHCR24，DWFl，HYDl，TAG、SM01，ERG3，STEl、SQLE、ERG，CYP51G1、CYP51G1、CYP51、SC5DL、Delta7-甾醇5-去饱和酶、角鲨烯单加氧酶、胆固醇6-异构酶、甾醇14-脱甲基酶，以上基因参与了皂苷的代谢，是皂苷合成的重要候选基因。
(7)结合皂苷代谢通路从以上基因中挑选出20个差异显著的基因，针对普洱景东种源滇重楼不同组织器官、不同种源及不同生长季节滇重楼的样本进行qPCR检测，发现20个基因表达量与不同种源的皂苷含量基本呈正相关;不同组织器官中的20个基因有17个基因表达量与不同组织器官的皂苷含量基本呈正相关;不同生长季节根茎中10个基因中有8个基因在1月份的休眠季节相对于5月份的开花期，其相对表达量较高，基因表达量基本与皂菅含量呈正相关。上述基因可能参与了滇重楼皂苷合成。
(8)从滇重楼根茎中克隆到HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)的基因全长序列，获得了全长1494bp的开放阅读框ORF(Open ReadingFrame)，编码497个氨基酸，命名为PpHMGR(GenBank登记号:MG601751):用生物信息学的方法对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白结构及功能的预测分析，并对该蛋白进行相似性检索、构建进化树，发现该氨基酸序列具有HMGR蛋白的保守序列，与川贝母(Fu/AS066849.1)相似性最高，达83％:利用实时荧光定量的方法检测该基因在滇重楼不同组织中的差异表达，结果表明PpHMGR在根茎的表达量明显高于叶片、地上茎和芽，其中在根茎3a龄段的表达量明显高于根茎1a龄段和5a龄段。
本研究收集了云南普洱景东、玉溪澄江、大理剑川、丽江永胜、楚雄大姚、文山丘北、曲靖马龙、昭通镇雄等8个地理种源的滇重楼，筛选出了总皂苷含量最高且生长速度较快的普洱景东种源作为生产和研究对象。通过测定其重楼皂苷含量，研究了不同组织器官、不同季节、不同地理种源滇重楼皂苷差异;在其含量最低、最高季节对其不同组织器官采样进行转录组测序，比对筛选出参与皂苷合成的关键候选基因，随机对其中20个基因进行了荧光定量PCR检测，并与皂苷含量进行相关性分析;克隆关键基因并用生物信息学的方法对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白结构及功能的预测分析。主要研究结果如下:
(1)普洱景东种源的滇重楼皂苷含量最高，含量高达1.57％;其根茎生长速度较快，根茎生物量年增长率为17.76％;生长期为10个月，为优质滇重楼种源，应大力发展。
(2)普洱景东种源滇重楼1.5a龄段的根茎、叶片、须根、茎、叶、花、芽、果皮和种子等部位均检测到重楼皂苷，含量从高到低排列为:根茎＞叶＞种子＞芽＞茎＞须根＞果皮＞花。除根茎外的其他部位的皂苷含量均未超过0.6％，但整个植株仍然具有开发利用价值，尤其是茎叶中总皂苷含量达0.16.0.52％，建议提取利用。根茎1.5a龄段中皂苷含量从高到低排序为:2a龄段＞3a龄段＞4a龄段、5a龄段＞1a龄段，其中根茎2a龄段中重楼总皂苷含量最高，1a龄段含量最低。
(3)普洱景东种源的滇重楼皂苷含量年周期规律如下:在休眠期1月份左右皂苷含量最高，在花果期皂苷含量最低，在根茎快速生长期含量适中。
(4)通过对普洱景东种源滇重楼8个样品的转录组测序，共获得69.84Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到6.15Gb，Q30碱基百分比在85.63％及以上。组装共得到79，867条Unigene，Unigene的N50为1,361，组装完整性较高;最终获得41，253个有注释信息的Unigene;其中KEGG的Unigene有14769条差异基因。对8份样品的转录组数据进行比较分析，共有23，816条差异基因，其中有13，183个Unigene上调表达，10,633个Unigene下调表达。
(5)通过分析滇重楼转录组基因功能注释数据，筛选重楼皂苷合成的相关基因，分别涉及甾体皂苷合成的上、中、下游通路。MVA通路中，共注释6个合成酶涉及到30条Unigene;MEP通路中，注释到7个合成酶涉及10条Unigene;一系列参与甾体骨架合成的候选基因，涉及6个合成酶18条Unigene;包括甾体皂苷元前体固醇的生物合成和甾体皂苷元的氧化和修饰过程的下游通路，涉及3类合成酶的221条Unigene;通过对滇重楼转录组数椐中Unigene功能注释分析，在与甾体皂苷生物合成相关的次生代谢通路中找到272条涉及22条代谢通路的Unigene，包括:AACr[EC:2.3.1.9]、∥β[EC:5.4.99.39]、CAS[EC:5.4.99.8]、SE[EC:I.14.99.7]、SQS[EC:2.5.1.21]、FPPS[EC:2.5.1.10]、GPPS[EC:2.5.1.29]、IPPI[EC:5.3.3.2]、HDR[EC:1.17.1.2]、HDS[EC:1.17.7.1]、MDS[EC:4.6.1.12]、CMK[EC2.7.1.148]、MCZ[EC:2.7.7.60]、DXR[EC:1.1.1.267]、DXS[EC:2.2.1.7]、PMD[EC:4.1.1.33]、PMK[EC:2.7.4.2]、MVK[EC:2.7.1.36]、HMGR[EC:1.1.1.34]、HMGS[EC:2.3.3.10]、UCrs[EC:2.4.1.173]、CYPs[EC:1.14.13.21]等，几乎覆盖了甾体皂苷合成通路中的所有节点，丰富了滇重楼皂苷载体生物合成通路酶基因信启、，有助于我们更好的了解滇重楼甾体皂苷合成通路。
(6)通过对滇重楼皂苷合成的K000100通路中各样本的差异基因比较发现:类固醇合成通路中下列基因在各组织样本间差异表达:FDFTl、ERG6、SMTl、SMT2、SM02，DHCR24，DWFl，HYDl，TAG、SM01，ERG3，STEl、SQLE、ERG，CYP51G1、CYP51G1、CYP51、SC5DL、Delta7-甾醇5-去饱和酶、角鲨烯单加氧酶、胆固醇6-异构酶、甾醇14-脱甲基酶，以上基因参与了皂苷的代谢，是皂苷合成的重要候选基因。
(7)结合皂苷代谢通路从以上基因中挑选出20个差异显著的基因，针对普洱景东种源滇重楼不同组织器官、不同种源及不同生长季节滇重楼的样本进行qPCR检测，发现20个基因表达量与不同种源的皂苷含量基本呈正相关;不同组织器官中的20个基因有17个基因表达量与不同组织器官的皂苷含量基本呈正相关;不同生长季节根茎中10个基因中有8个基因在1月份的休眠季节相对于5月份的开花期，其相对表达量较高，基因表达量基本与皂菅含量呈正相关。上述基因可能参与了滇重楼皂苷合成。
(8)从滇重楼根茎中克隆到HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)的基因全长序列，获得了全长1494bp的开放阅读框ORF(Open ReadingFrame)，编码497个氨基酸，命名为PpHMGR(GenBank登记号:MG601751):用生物信息学的方法对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白结构及功能的预测分析，并对该蛋白进行相似性检索、构建进化树，发现该氨基酸序列具有HMGR蛋白的保守序列，与川贝母(Fu/AS066849.1)相似性最高，达83％:利用实时荧光定量的方法检测该基因在滇重楼不同组织中的差异表达，结果表明PpHMGR在根茎的表达量明显高于叶片、地上茎和芽，其中在根茎3a龄段的表达量明显高于根茎1a龄段和5a龄段。