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研究背景环己酮二腙(cuprizone,CPZ)是一种铜离子的整合剂,1966年Carlton观察到给予CPZ后的小鼠可出现血清铜含量下降和脑白质脱髓鞘病变,此后在接下来的三十年中,CPZ被广泛应用于脱髓鞘疾病的病理、化学分子机制及治疗的研究。CPZ诱导的脑白质脱髓鞘改变是可逆性的损伤,在停止喂养含CPZ饲料后,小鼠脑白质可出现自发的髓鞘再生,这使该模型可以模拟多发性硬化(Multiplesclerosis,MS)发病急性期及复发缓解的特点,且与MS的3型具有明显的病理相似性,因此被广泛应用于MS发病机制及治疗的研究。研究CPZ诱发的脑白质脱髓鞘病变,在不同的动物种系、年龄、不同的给药方式及给药剂量可产生不同部位脑白质的病变及预后,但目前国内尚无统一的造模标准,而标准动物模型的运用,更有利于对实验结果的统一及判断。C57BL/6J小鼠是CPZ模型最常用的动物种系,但该种系在CPZ模型中脱髓鞘病变及自发性的髓鞘再生能力是否存在性别差异仍然存在争议,是否适用于MS性别差异的研究需进一步的研究。CPZ作为铜离子的螯合剂,目前在体内的物理化学行为及致毒机制仍然未知,揭开CPZ在体内的物理化学行为及致毒机制,可以更好的利用该模型,也可以为脱髓鞘疾病病因提供一些研究线索。研究目标建立CPZ诱导脑白质变性脱髓鞘模型,探讨C57BL/6J小鼠这一动物种系在该模型中是否存在雌雄异常,为做MS性别差异性研究时选择合适的动物模型提供参考,并进一步探索在标准建模下小鼠脑组织中的铜、铁及锌含量是否发生改变,推测CPZ致病原因是否依赖于铜离子螯合剂这一理化性质,为下一步进一步探讨CPZ在体内的物理化学行为提供参考。方法1.CPZ致脑白质脱髓鞘病变模型的建立将16只雄性C57BL/6J小鼠,随机选取8只为造模组,8只为对照组。对照组用常规饲料饲养,造模组用含0.2%CPZ饲料饲养6周。第6周末将造模组及对照组行运动协调能力测试后,处死取脑组织。所有脑组织均行卢卡斯快蓝(Luxol Fast Blue,LFB)染色、脑细胞凋亡比值、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫组织化学染色并计算累积光密度值。2.CPZ致C57BL/6J小鼠脑白质脱髓鞘雌雄差异性研究48只C57BL/6J小鼠,雌雄各半,随机选取32只为造模组,16只为对照组(A组),对照组常规饲养,造模组用含CPZ饲料饲养6周,造模成功后再随机分为脱髓鞘组(B组)和髓鞘再生组(C组),A组和B组于6周末行运动协调能力测试后处死取脑组织,C组继续常规饲养6周后行运动协调能力测试后处死取脑组织,所有脑组织均行LFB染色、MBP免疫组化染色和细胞凋亡比值检测。3.CPZ致脑白质脱髓鞘模型中小鼠脑组织铜、铁、锌含量的改变将48只C57BL/6J小鼠,随机分为实验组和对照组。对照组用常规饲料饲养,实验组用含0.2%CPZ饲料饲养,分别于第2周末、第4周末、第6周末、第12周末处死取脑组织。脑组织行LFB染色,MBP免疫组化染色,利用火焰原子吸收光谱法分别测量脑干、小脑、基底节、大脑皮质的总铜、总铁及总锌含量。统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。数据以均数±标准差(x±s)表示,组间采用单因素方差分析,组内采用两独立样本t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.与对照组比较造模组在旋转棒上的运动时间减短,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较造模组在旋转棒上掉落的次数增多,差异有统计学意义(P<0.05);光镜下观察LFB染色结果,与对照组比较造模组神经纤维结构紊乱,髓鞘染色深浅不一,髓鞘肿胀,断裂,可见明显液泡形成。与对照组比较,造模组小鼠脑胼胝体部位的神经细胞凋亡比值增多,差异有统计学意义(P<0.05);造模组MBP积累光密度值明显小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.对比A组,B组运动协调能力及MBP含量降低(P<0.05),脑细胞凋亡比值及脱髓鞘病变程度评分增加(P<0.05)。C组运动协调能力及MBP含量较B组增高(P<0.05),脑细胞凋亡比值及脱髓鞘病变程度评分较B组低(P<0.05)。B组组内雌雄比较运动协调能力、脱髓鞘病变程度评分、脑细胞凋亡比值、MBP含量均无显著性差异(P>0.05)。C组组内比较,雌组比雄组运动协调能力好、脱髓鞘病变程度评分低及MBP含量高,脑细胞凋亡比值则无显著性差异。3.实验组在第2周时胼胝体尚未发生脱髓鞘改变,此时与对照组相比,实验组脑干、小脑、前额皮质总铜含量无显著性差异(P>0.05),而基底节区总铜含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);第4周时,实验组胼胝体发生不完全性脱髓鞘改变,此时与对照组相比,实验组脑干、基底节区总铜含量升高,差异有统计学意义(P<0.05),而小脑、前额皮质总铜含量无显著性差异;第6周时,实验组胼胝体发生完全性脱髓鞘改变,与对照组比较,实验组脑干、基底节总铜含量升高,差异有统计学意义(P<0.05),而小脑、前额皮质总铜含量无显著性差异(P<0.05);第12周时,实验组胼胝体神经细胞含量明显减少,间质含量增多,此时与对照组比较脑干、小脑、基底节部位全铜含量均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),前额叶皮质与对照组比较,总铜含量无显著性差异(P>0.05)。在第2周、第4周及第6周实验组脑干、小脑、基底节及前额叶皮质铁含量与对照组比较,均无显著性差异(P>0.05)。在第12周实验组脑干、小脑、基底节总铁含量与对照组相比均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而前额叶皮质含量与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。在第2周、第4周、第6周及第12周实验组脑干、小脑、基底节及前额叶皮质锌含量与对照组比较,均无显著性差异(P>0.05)。结论1.用含0.2%CPZ饲料饲养8周龄C57BL/J小鼠6周,可诱导脑白质发生广泛的脱髓鞘病变,该模型造模过程简单,重复性好,无复杂操作,价格低廉,实验周期短,评价指标易检测是研究脱髓鞘疾病的可靠动物模型。2.CPZ致C57BL/6J小鼠脑白质脱髓鞘病变无雌雄差异,在髓鞘再生期,雌性小鼠具有更好的髓鞘再生能力。3.CPZ作为铜离子的螯合剂,并没有使脑组织中铜含量减少,相反,导致了脑组织中总铜含量上升,可能的原因为CPZ干扰了铜离子细胞内外正常的转运,导致脑组织中铜异常沉积。CPZ导致的脑白质脱髓鞘病变,并非是CPZ螯合了铜离子导致铜缺乏所致的神经系统损害。目前尚需更多的实验进一步探索CPZ在体内的理化行为才能揭开其导致脑白质脱髓鞘病变的机制。而铁离子的沉积极有可能是继发于含铁丰富的少突胶质细胞凋亡后释放导致。