牛传染性鼻气管炎病毒(Infection Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、疱疹病毒属。可以引起牛的急性发热、流鼻涕、厌食、咳嗽、流产等症状,会导致奶牛的泌乳量下降以及牛乳蛋白含量的降低。在欧洲、北美洲等畜牧业大国广泛流行,非洲和南美洲则关于IBRV的报道较少,IBRV的流行给畜牧业造成了巨大经济损失,是养牛业目前面临的主要难题之一。上世纪80年代初期,我们国家首次从新西兰进口的牛内体分离到了IBRV,但是由于当时对该病毒的危害性认识不足,没有及时采取严格的防控措施,导致IBRV在我国大范围流行开来。目前在欧洲一些经济发达的国家,多采用大范围捕杀的方式消灭带病牛,但这种方式成本过大,显然不适合经济欠发达的发展中国家。因此,我们就要必须充分研究和了解IBRV作用于宿主的致病机制,而从寻找到预防、治疗IBRV的方法。近年来,虽然反向遗传学的发展为我们研究病毒分子结构和致病机制提供了强有力的技术支持,但病毒作为一种细胞内寄生的生物,其在细胞内的生命活动很大程度受限于其抵御和逃避细胞防御系统的能力。因此,从宿主细胞的角度出发去研究IBRV的致病机制是必不可少的。细胞自噬(Autopphagy)是真核细胞在进化过程中高度保守的胞内降解机制,与蛋白酶体降解泛素标记的特异性蛋白相比,自噬主要通过降解细胞内受损和功能失调的细胞器以及特定的大分子蛋白质的方式来维持细胞内环境的平衡;自噬的另一个重要功能是作为细胞的防御系统帮助细胞抵御病原微生物的入侵,目前的研究表明自噬在病毒侵染细胞中过程中扮演着重要的角色,一方面,自噬能够帮助细胞抵御外源入侵的病原微生物,当病毒进入到细胞后,自噬小体(Autophagosome)将病毒粒子包裹运送到溶酶体被降解进而排除到细胞外。而另一方面,在病毒与宿主细胞在漫长的进化的相互“博弈”过程中,病毒也进化出了一套十分精细逃避甚至利用细胞防御系统的机制。在这种机制下,病毒可以将自噬小体变成自身在胞内的“避难所”,并在自噬体内完成增殖复制。所以,探究病毒感染与细胞自噬的关系不能一概而论,即使在同科病毒中,情况往往也有很大的不同。为了探究IBRV感染对细胞自噬的影响以及自噬对IBRV增殖复制能力有何影响,我们开展了如下探究:(1)IBRV感染牛肾细胞(MDBK)能够引起不完全自噬:为了检测IBRV感染MDBK细胞后能否诱导自噬,我们使用IBRV感染MDBK细胞后,利用透射电镜观察细胞中自噬小体的积累情况,利用Western Blot检测LC3-Ⅱ,p62表达量的变化,以及使用溶酶体抑制剂CQ检测自噬流的完整性,结果表明:在病毒感染24小时后,MDBK细胞内产生了明显多于未感染组的自噬小体,并且也多于使用自噬促进剂雷帕霉素(Rapa)处理的阳性对照组。Western Blot的结果显示,在感染IBRV 12h和24h小时,LC3-Ⅱ/β-actin比值升高,p62/β-actin的比值则没有明显变化。为了验证自噬的完整性,进一步我们利用CQ抑制了自噬体与溶酶体的结合,再加入IBRV感染后,此时LC3-Ⅱ/β-actin和p62/β-actin比值都没有明显变化。这些结果说明了IBRV感染MDBK细胞能够引起自噬,且这种自噬为不完全自噬。(2)自噬能够降低IBRV的增殖复制能力:为了进一步探究自噬对IBRV增殖复制的影响,首先通过Rapa和自噬抑制剂渥曼青霉素(Wort)处理MDBK,Western Blot检测LC3-Ⅱ/β-actin的变化,结果显示Rapa和Wort在MDBK细胞中可以明显促进和抑制自噬,接着我们利用TCID50检测病毒滴度以及利用实时荧光定量PCR检测病毒基因拷贝数的变化,结果表明当细胞自噬水平升高后,病毒滴度和基因拷贝数都有所降低,而当细胞自噬受到抑制后,病毒滴度和基因拷贝数都升高,这个结果表明了在MDBK细胞中,自噬能够降低IBRV的增殖复制能力。本文以MDBK细胞作为模式细胞,初步证明了细胞自噬与IBRV感染存在重要的联系,为深入了解IBRV的致病机制奠定基础以及为IBRV的防控和治疗提供了新的思路。