论文部分内容阅读
目的:肝脏内过多的脂质沉积可阻断Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs)的自噬流,导致炎症小体的激活,从而加重肝脏内脂质沉积导致的炎症反应。叉头蛋白O3a(forkhead box protein O3a,Foxo3a)是连接炎症反应和能量代谢的重要转录因子。但是,在高脂饮食(high fat diet,HFD)的条件下,Foxo3a调节KCs自噬并抑制炎症小体激活的机制尚不清楚。因此,本实验将研究非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型小鼠中,KCs中Foxo3a的变化以及调节KCs自噬流并抑制炎症小体活性的机制。方法:1.梯度浓度的棕榈酸(palmitic acid,PA)(0,0.16,0.32,0.64 m M)以及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(100 ng/ml)联合刺激体外的KCs12 h:1)蛋白印记法(western blotting assay,WB)检测:(1)自噬相关蛋白如Beclin 1和LC3;(2)NLRP3炎症小体(nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)相关蛋白如:NLRP3、caspase 1和凋亡相关斑点蛋白(apoptosis associated speck-like protein,ASC);(3)Foxo3a及上游相关蛋白如:腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate ativated protein kinase,AMPK)、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidyl inositol3-kinase,PI3K)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein serine threonine kinase B,Akt)的表达变化。(2)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测细胞上清白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18的含量。(3)利用2′7′-二乙酰二氯荧光素(dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针并荧光显微镜观察KCs中活性氧产生的情况。2.(1)分别用Foxo3a过表达质粒(Foxo3a overexpression plasmid,Foxo3a-OE)和Foxo3a-短发夹RNA质粒(Foxo3a-short hairpin RNA plasmid,Foxo3a-sh RNA)转染KCs 48 h后,再利用PA和LPS联合刺激KCs 12 h:(1)WB检测自噬相关蛋白及NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化;(2)ELISA检测细胞上清IL-1β和IL-18的含量;(3)透射电镜观察KCs自噬小体的分布情况。(2)m RFP-EGFP-LC3缺陷腺病毒感染KCs 48 h后,先利用Foxo3a激动剂Iturin A预处理KCs 1 h,再利用PA和LPS联合刺激KCs 12 h,最后利用荧光显微镜观察LC3标记的自噬小体的分布情况。3.(1)Foxo3a-OE转染KCs 48 h后,利用PA和LPS联合刺激KCs 12 h,再利用荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)检测Foxo3a转录下游靶分子的m RNA表达情况。(2)利用Bim-OE及Bim-sh RNA体外转染KCs 48 h后,先分别利用Foxo3a抑制剂SC97和激动剂Iturin A预处理KCs 1 h,再利用PA和LPS联合刺激KCs 12 h,检测:(1)WB检测自噬相关蛋白及NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化;(2)ELISA检测细胞上清IL-1β和IL-18的含量。4.24只清洁级小鼠随机分为3组,即正常饲料组(coarse food diet group,CFD),高脂饲料组(high fat diet,HFD)和高脂饲料联合Iturin A腹腔注射组(Iturin A),每组8只。3组小鼠均喂养16周后,分别取小鼠的肝脏及外周血:(1)HE染色检测肝脏脂肪变情况;(2)全自动生化分析仪检测小鼠肝功能及血脂水平;(3)透射电镜观察肝脏组织KCs中的自噬小体分布情况;(4)分离肝组织中KCs,并提取其总RNA和蛋白后:(1)WB检测自噬相关蛋白及NLRP3炎症小体相关蛋白的表达情况;(2)RT-PCR检测IL-1β和IL-18的m RNA水平。结果:1.PA联合LPS刺激体外KCs组与单独LPS处理KCs组比较:(1)自噬相关蛋白Beclin1表达下降,LC3Ⅱ/Ⅰ的表达比例升高;(2)NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、caspase 1 p10、IL-1β和IL-18的表达水平升高;(3)Foxo3a表达下降,p-Foxo3a、p-Akt和p-PI3K的表达升高,而p-AMPK表达无变化;(4)ROS产生明显增多。2.(1)KCs过表达Foxo3a后,可明显促进KCs自噬流,并抑制由PA联合LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活;(2)KCs沉默Foxo3a后,可进一步抑制KCs自噬流,以及进一步促进由PA联合LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活。3.(1)KCs过表达Foxo3a后,PA联合LPS刺激组中只有Bim的m RNA表达明显低于单独过表达Foxo3a组;(2)(1)沉默KCs中的Bim,即使给予Foxo3a激动剂,KCs的自噬流仍然受阻,并促进由PA联合LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活;(2)过表达KCs中的Bim,即使给予Foxo3a抑制剂,KCs的自噬仍然顺向进行,并抑制由PA联合LPS诱导的NLRP3炎症小体的激活。4.Iturin A组小鼠与HFD组小鼠比较:(1)肝组织脂肪变及炎症反应较轻;(2)肝功能及血脂水平较低;(3)肝组织KCs中的自噬小体分布较多;(4)KCs中Foxo3a与Bim的表达明显升高,自噬被激活,高脂饮食诱导的NLRP3炎症小体的活性较低。结论:1.游离脂肪酸通过影响Foxo3a的磷酸化,阻断KCs的自噬流,并促进NLRP3炎症小体的激活。2.Foxo3a通过恢复KCs的自噬流,抑制由游离脂肪酸诱导的NLRP3炎症小体的活性。3.Foxo3a通过促进Bim的转录活性,诱导KCs的自噬,并抑制由游离脂肪酸诱导的NLRP3炎症小体的活性。4.Foxo3a激动剂Iturin A通过促进Bim的转录活性,减轻小鼠肝脏由于脂质沉积导致的脂肪变和炎症反应。