论文部分内容阅读
研究背景及目的:输血已成为临床上最重要的治疗手段之一,但是,输血安全在输血医学中却是一个永恒的主题。安全、有效的输血要求我们对成分非常复杂的血液制品应该有更为明确的理解。现阶段我国临床使用的血浆制品有新鲜冰冻血浆、普通冰冻血浆和冷沉淀三种,新鲜冰冻血浆(fresh frozen plasma, FFP)是成分输血的重要组成部分,由于献血者个体上的差异,导致单人份的血浆间分子水平上存在巨大的个体差异,本研究旨在探讨不同献血者的新鲜冰冻血浆对肿瘤细胞体外增殖的影响。方法:选取来自解放军总医院输血科男性无偿献血者捐献的新鲜冰冻血浆,体外培养人肝癌细胞HepG2、胃癌细胞AGS,细胞贴壁后与不同献血者的新鲜冰冻血浆共同孵育24h,分别应用3- (4,5-二甲基噻唑-2) -2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5) -dimethylthiahiazo (-z-yl) -2,5-diphenytetrazolium Bromide, MTT)和实时细胞电子分析技术(Real-time cell-based assay,RTCA)方法测定不同献血者的新鲜冰冻血浆对肿瘤细胞体外增殖的影响程度,筛选出对肿瘤细胞增殖具有显著差异的新鲜冰冻血浆,并采用Luminex液相芯片技术检测这些具有差异的新鲜冰冻血浆中肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素-1b (IL-1b)、白介素-6 (IL-6)、血管内皮生长因子(VEGF)、趋化蛋白-1 (MCP-1)、正常T细胞的表达和分泌因子(RANTES)和血小板衍生生长因子-AB/BB (PDGF-AB/BB)这7种细胞因子的水平,同时利用SELDI/TOF-MS技术和RayBiotech生物素标记抗体芯片方法分析不同献血者新鲜冰冻血浆的蛋白水平。结果:(1)本研究应用不同浓度、不同年龄组献血者的混合FFP处理细胞24小时后,发现混合液对肿瘤细胞增殖具有明显的促进作用,并且呈剂量依赖性;当终浓度为10%时,与对照组相比,不同年龄组献血者的FFP对HepG2细胞增殖并无明显差异;>50岁年龄组不同浓度的FFP混合液(终浓度为20%、30%和40%)与肿瘤细胞体外共培养的OD值分别为0.629、0.699和0.821,明显高于21～30年龄组不同浓度FFP混合液的0.453、0.538和0.584 (P=0.0298、P=0.0203和P=0.0241);不同献血者的FFP与HepG2细胞共同孵育,用MTT方法检测体外细胞的增殖状态,结果显示,编号为14的FFP与HepG2细胞孵育后的OD值为0.964,明显高于编号为23的FFP与HepG2细胞孵育后的OD值为0.677 (P=0.0000)。(2)不同献血者的FFP与HepG2细胞体外共培养,应用MTT方法与RTCA方法检测肿瘤细胞体外增殖的作用,比较发现两种方法具有良好的相关性,差异无统计学意义;应用RTCA方法对68例不同献血者的新鲜冰冻血浆肝癌HepG2细胞及胃腺癌AGS细胞两种细胞细胞体外增殖作用进行检测,实验结果显示不同献血者的新鲜冰冻血浆对胃腺癌AGS细胞和HepG2细胞增殖的结果和趋势基本一致。(3)不同献血者的FFP制品与肿瘤细胞共培养后,呈现出不同的增殖状态。本研究应用RTCA方法实时监测不同献血者的新鲜冰冻血浆对HCC细胞株HepG2体外增殖的状况,筛选出CI值不同的两组新鲜冰冻血浆。Luminex液相芯片技术结果显示CI值不同的两组(CI值>7.0和CI值<3.0)新鲜冰冻血浆中PDGF-AB/BB、VEGF浓度具有明显差异;应用SELDI-TOF-MS技术对CI值不同的(CI值>8.0和CI值<3.0)两组样本进行检测,结果显示两组的新鲜冰冻血浆蛋白表达谱具有明显差异,经过对鉴定获得的差异蛋白进行分析发现肿瘤转移抑制基因、皮质抑素、血小板第4因子、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1、基质细胞衍生因子、Lactotransferrin、转化生长因子a等26种差异表达的蛋白,说明不同献血者本身体内相关生长因子和蛋白存在巨大差异,从而导致相应的FFP制品中生长因子类物质浓度的异常升高,因此有可能增加对体外HepG2细胞体外增殖的正向作用。(4)用MTT方法检测30例增殖组中不同献血者混匀的FFP和9例抑制组不同献血者混匀的FFP处理肝癌细胞的增殖率,发现两组混匀后的FFP对肿瘤细胞的存活率差异具有统计学意义。应用RayBiotech生物素标记抗体芯片发现增殖组血浆中的 Smad 4、Glut2、VEGF、MIP 2、MMP-7、TIMP-1、ALCAM、RANTES、IL-1b、IL-6、MCP-1、TNF-a蛋白量表达量显著上调。结论:(1)不同献血者的新鲜冰冻血浆对HepG2细胞体外增殖的作用具有明显差异。(2)新鲜冰冻血浆制品中生长因子及蛋白的’浓度差异引起对体外肿瘤细胞增殖的差异。