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ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 Polyunsaturated fatty acid，ω-3PUFA）是一类主要来源于海洋生物的重要营养素，与机体脂类代谢等过程密切相关。由于可以显著降低血浆甘油三酯（TAG）和极低密度脂蛋白（VLDL）水平，提高高密度脂蛋白（HDL）水平，抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成等作用，临床上已应用于抗血栓等心血管病的治疗。研究发现ω-3PUFA可以在体内外通过多种方式有效抑制肿瘤细胞的增殖和转移，临床肿瘤患者大剂量应用ω-3PUFA也未见严重的毒副作用，因此有望成为新型的防癌抗癌药物。过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator-activated receotors，PPARs）的发现进一步阐明了ω-3 PUFA众多生物学效应的一个重要机制。作为高亲和力配体，ω-3PUFA可以通过激活此胞内受体，调控众多带有PPAR反应元件（Peroxisome proliferator responsive element，PPRE）基因的表达，诱导众多细胞事件的发生。 跨膜型肿瘤坏死因子α（Transmembrane tumor necrosis factor α，tmTNF α）是一种具有多种生物学功能的细胞因子，由多种活化的免疫细胞产生，依赖细胞间的直接接触，通过激活细胞膜TNF受体（TNF receptor, TNFR）发挥细胞毒性作用。研究发现tmTNFα可以抑制多种肿瘤细胞增殖，而且与分泌型肿瘤坏死因子α（Secreted TNFα，sTNFα）相比，具有更广泛的杀瘤谱和更强的诱导凋亡作用，因此在肿瘤治疗研究中具有重要的应用价值。 基因治疗的临床研究表明，在目的基因上游建立一个有效的“基因开关”（gene switch），通过药物或激素等外源因子，使该调控系统准确地控制目的基因定时、定量和定位转录表达，能够提高基因治疗的准确性、特异性和有效性．在本课题中，首先运用DNA重组技术和真核细胞转染技术，使肿瘤细胞在ω-3PUFA诱导下高效稳定表达外源性的tmTNF α，然后以细胞凋亡事件为主要研究内容，探讨两者协同作用对肿瘤细胞的影响及相关机制，为进一步了解ω-3PUFA和tmTNF α抗肿瘤机制以及临床应用提供一定的理论依据。 为此，本研究首先构建带有PPRE-tk启动子片段的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因载体，证明了通过这个特异的启动子片段，ω-3PUFA可以诱导下游靶基因高效表达，并呈一定的时间、剂量依赖关系。第三军医大学硕士学位论文 在此基础上进一步构建带有相同PPRE调控元件的tmTNFQ真核表达载体，以人白血病HL一60细胞和乳腺癌MCF一7细胞为研究对象，建立稳定转染重组载体的肿瘤细胞株，应用RT一PCR和免疫荧光细胞化学方法检测。一3PUFA对转染细胞外源性tmTNF。表达的调控。采用细胞生长曲线测定、MTT比色实验、流式细胞分析和DNA梯形带检测等技术观察。一3PUPA对转染和未转染pPPRE一tmTNF“表达载体的肿瘤细胞增殖功能、细胞周期和凋亡的影响;通过RT一PCR和蛋白印迹等技术检测细胞casPase家族表达的变化，应用caspase一8特异性底物Ac一IETD一AMC检测肿瘤细胞casPase一8活性的变化，用casPase一8特异性抑制剂Ac一IETD一CHO检测其对。一3 PUFA协同外源性tmTNF。抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的拮抗作用。主要实验结果和结论如下: 1.运用DNA重组技术构建带有PPRE一tk调控元件的tmTNFQ真核表达载体，建立稳定转染的HL一60和MCF一7细胞株。经RT一PCR和荧光免疫细胞化学检测发现转染细胞表达的外源性t切LTNFQ基因产物定位于细胞膜，经。一3PUFA处理后mRNA和蛋白表达显著增加，呈一定的时间、剂量依赖关系，说明。一3PUFA可调控的tmTNFa真核表达载体构建成功。 2.PPPRE.tmTNF。转染和未转染的HL60和MCF-7细胞经。一3PUFA处理后，增殖功能均受抑制，其中HL一60细胞周期被阻滞在G夕G，期、细胞凋亡率增加、可检测到DNA梯形带，转染细胞上述变化更为显著。。一3PUFA对MCF一7细胞细胞周期及凋亡率未见明显影响，而转染PPPRE一tm侧F。的MCF一7细胞己经出现细胞凋亡事件，经。一3PUFA处理后凋亡效应更为显著。这些结果说明。一3PUFA协同外源性tmTNFQ基因产物可以更为有效的抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。 3.pppRE一tmTNFQ转染和未转染的HL一60细胞经。一3PUFA处理后，可见细胞easpase一l、3、s和9 mRN^和蛋白表达增加，easpase一8活性增高，转染细胞上述变化更为明显。。一3Pu队对MCF一7细胞casPase表达和活性未见明显影响;转染PPPRE一tmTNF。的McF一7细胞可以检测到casPase一8活性的增强，经。一3PUFA处理后easpase一1、8和9表达和活性明显增加（M CF-7细胞缺失easpase一3），凋亡效应更为显著。应用casPase抑制剂能部分拮抗。一3PUFA和/或tmTNF“对肿瘤细胞诱导凋亡和抑制增殖的作用。以上结果说明caspase途径在。一3PUFA和域tmTNF“诱导的肿瘤细胞凋亡中可能发挥重要作用，根据caspase凋亡机制的不同，推测TNFR介导的细胞凋亡效应和线粒体依赖的凋亡途径可能是。一3PUFA协同tmTNFQ诱导肿瘤细胞凋亡的主要相关机制。 综上所述，。一3 PUFA协同外源性 tmTNFQ可以更为有效的诱导肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖，与TNFR和/或线粒体相关的casPase级联调控网络可能与这个细胞凋亡信第三军医大学硕士学位论文