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目的:复制ox-LDL(100μg/ml)诱导的HUVECs氧化损伤模型,并从熊果酸通过Sirt1/Atg5上调自噬抵抗ox-LDL所致HUVECs氧化应激的角度探讨其保护作用机制。方法:以体外培养的HUVECs为实验对象,建立细胞氧化损伤模型,并筛选出熊果酸最佳预保护时间及作用浓度。实验分组如下:正常对照组,模型组,熊果酸组,模型+熊果酸组,模型+维生素E组、自噬抑制剂3-MA组及Sirt1抑制剂EX-527组。采用CCK-8法检测各组细胞存活率;化学酶法检测细胞H2O2、MDA、SOD、NO及NOS水平;透射电镜观察细胞超微结构;ESR自旋捕捉技术同时定量检测NO及ROS的释放量;Western blotting检测Sirt1、LC3B、p62、Atg5蛋白表达;免疫沉淀法检测乙酰化Atg5蛋白。结果:复制了ox-LDL诱导的HUVECs氧化损伤模型;模型组细胞SOD、NOS、NO水平下降,MDA、H2O2含量增多;而加入5-20μM熊果酸预保护16h后,细胞存活率、SOD、NOS、NO水平上升,MDA、H2O2产生减少,且呈剂量依赖性(P<0.05)。透射电镜观察细胞超微结构可见,正常组HUVECs细胞质密度均匀,细胞器形态正常;模型组细胞质浓缩,可见大量电子致密颗粒,偶见多层膜包绕的泡状结构;熊果酸组细胞内出现大量自噬相关结构。Western blotting结果表明,ox-LDL损伤24h对Sirt1、LC3B及p62蛋白表达水平无明显影响(P>0.05);而单独熊果酸及熊果酸预保护16h的内皮细胞中Sirt1蛋白表达上调,且均有LC3BⅡ/Ⅰ比值升高并伴随p62蛋白水平的降低(P<0.05)。加入3-MA或EX-527预孵育2h后,细胞生存率与熊果酸预保护组相比明显下降(P<0.01)。ESR结果显示,模型组细胞内NO释放量显著下降伴随ROS释放量显著增多,熊果酸预保护16h可逆转上述趋势,而3-MA或EX-527会减弱熊果酸的保护作用(P<0.05)。另外,EX-527会使熊果酸预保护组Sirt1蛋白水平及LC3BⅡ/Ⅰ比例明显下降,p62表达升高;免疫沉淀结果可见,熊果酸预保护16h后,HUVECs内乙酰化Atg5蛋白表达量明显减少,而加入EX-527后,对应的乙酰化Atg5蛋白则相应增多。结论:100μg/ml的ox-LDL作用24h能够诱导HUVECs发生氧化损伤,而5-20μM熊果酸可呈剂量依赖性提高细胞生存率并改善细胞氧化应激,建立了ESR自旋共振捕捉技术同时定量检测HUVECs内NO和ROS含量的方法,证明熊果酸的抗氧化保护作用是通过上调Sirt1/Atg5进而激活自噬实现的。