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土壤盐渍化是影响农林业生产和生态环境的严重问题,通过基因工程手段提高植物的耐盐性从而改善和利用盐渍化土壤是减轻土壤盐渍化危害的有效措施。甘露醇是小分子渗透调节物质的一种,它对逆境中的植物细胞具有渗透调节和保护作用,通过甘露醇的积累能提高植物的抗盐、抗旱等特性。MtlD基因是甘露醇合成过程中的关键酶基因,外源MtlD基因的导入能使原本不能合成甘露醇的植物积累甘露醇,从而提高其抗逆性。
本文旨在通过MtlD基因提高木本植物毛白杨的耐盐性,主要研究内容包括转MtlD基因毛白杨的分子鉴定、主要糖类代谢产物的分析以及转基因毛白杨的耐盐性研究。目的基因的PCR检测、PCR-Southern分析和Southern印迹杂交结果表明,外源MtlD基因成功整合到植物基因组中,Northern印迹杂交和糖醇分析结果表明,MtlD基因在植物体内能正常表达,而且最终导致甘露醇的合成。转基因试管苗和水培温室苗的耐盐性试验证明,转MtlD基因毛白杨在盐胁迫下的生根能力及生长状况明显强于对照植株。转基因植株的分化芽在含50mMNaCl的生根培养基上能正常生根,而对照植株分化芽不能正常生根,并逐渐黄化死亡。温室水培试验中,转基因植株能在含75mMNaCl的营养液中正常生长,蒸腾速率、光合速率、气孔导度等生理指标仍维持在生长水平,而对照植株逐渐萎蔫死亡。
糖与糖醇的含量分析贯穿本研究的始终,正常生长条件下的转基因植株的甘露醇含量明显高于野生型植株,但是其葡萄糖和蔗糖含量与野生型植株相比却明显下降,这可能是转基因毛白杨发生形态矮化的原因之一:甘露醇的合成导致用于植物生长代谢的能量物质的减少,从而引起生长缓慢。在盐胁迫条件下,各株系转基因植株的甘露醇含量没有发生明显变化,葡萄糖和蔗糖呈不规律的下降趋势,在较高盐浓度下光合速率等生理指标也呈下降趋势,因此导致其生长速率的进一步下降。
糖与糖醇含量的准确分析是建立在适当的分析方法基础之上的,气相色谱法具有速度快、灵敏度高等突出优点。本研究首先在前人工作的基础上,进一步优化了糖与糖醇的乙酰化衍生方法,确定了适宜的反应条件,如反应温度、时间、剂量等;其次,针对生物学实验中普遍存在的用于目标化合物提取的材料不足的问题,逐步改进和完善了糖与糖醇的提取、分离及衍生化等前处理操作,建立了准确可靠、方便节省、维护环保、适用范围广的微量分析技术及超微量分析技术,能实现准确分析毫克甚至微克量级植物或其它材料中糖与糖醇的含量。
本研究成功鉴定了转MtlD基因的毛白杨植株,并且在离体和温室条件下分别验证了转基因植株的耐盐性有一定的提高,但在大田条件下其耐盐性如何还需进一步试验论证。另外,研究过程中发现转基因植株形态发生了明显的矮化现象,从本研究的结果中能找到关于此现象发生的部分原因,但关于转基因植物的矮化机理还需要更深入的研究。这两点也是本文作者对后续研究工作的建议。