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研究背景：心脑血管疾病是严重危害人类健康的主要慢性非传染性疾病。其中冠心病和脑卒中是世界上最常见的死亡原因。在我国随着人口的老龄化,以冠心病,脑卒中为代表的心脑血管疾病其发病率,致死率及致残率呈逐年上升的趋势。尽管现在已经发现了许多心脑血管疾病的危险因素,如高血压,糖尿病,血脂代谢的异常,男性,年龄,体重,体重指数等。然而这些危险因素只能解释部分病人,因此寻找新的心脑血管疾病危险因素将具有重要的临床意义。基础研究证明,激肽-缓激肽系统(Kallikrein-Kinin/bradykinin system, KKS)与肾素血管紧张素系统(Renin-Aangiotensin System, RAS)相互作用并在心脑血管疾病的发生发展中具有重要的作用。人组织激肽释放酶(TK)是一类丝氨酸蛋白酶,能促进低分子激肽原释放血管活性肽从而发挥一系列的生物活性作用,命名为KLK1。在人和动物的高血压、心血管疾病和肾脏疾病的模型中,均可见到人组织激肽释放酶的含量降低。我们在转基因的动物模型中发现人组织激肽释放酶具有降低血压,改善胰岛素抵抗和改善肾功能的作用。另外,大量研究还证明人组织激肽释放酶具有抑制细胞凋亡,炎症,纤维化和肥大,促进血管生成和神经发生的作用。因此,人组织激肽释放酶的水平在人的心脑血管疾病的发生发展的过程中可能具有重要的临床意义。由于人组织激肽释放酶在心血管疾病的保护作用已得到基础研究及动物实验的充分证明,而其在冠心病和脑卒中的临床研究中国际上还未涉及。因此,对人组织激肽释放酶的含量与冠心病和脑卒中的关系的病例-对照研究和队列研究具有较好的应用前景。鉴于人组织激肽释放酶的含量检测的应用前景,国外已有关于人组织激肽释放酶含量检测的ELISA试剂盒,但是其操作过程繁琐并且价格昂贵难于获得,而目前国内尚无此类的高效检测试剂盒。而建立具有高灵敏度、高特异性的人组织激肽释放酶含量测定ELISA试剂盒,需要制备特异性强,效价高并可以大量生产的抗人组织激肽释放酶的抗体及较纯的人组织激肽释放酶的蛋白或融合蛋白。本研究首先制备了高纯度并方便大量生产,具有高特异性及高灵敏度的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体,同时制备了人组织激肽释放酶融合蛋白并将其纯化。然后建立了针对人组织激肽释放酶的高效ELISA检测试剂盒,同时建立检测血浆中人组织激肽释放酶的ELISA法。我们同时采用病例-对照研究和队列研究在评估人组织激肽释放酶与脑卒中的关系的同时判定其对卒中再发的预测价值。另外,我们采用病例-对照研究的方法评估了血浆中人组织激肽释放酶与冠心病的发病率及严重程度的关系。我们还对血浆中人组织激肽释放酶的含量和血脂的关系进行了评估。最后,我们对冠心病患者中ACEI类药物的使用情况及与血浆人组织激肽释放酶的含量进行了评估。方法：(1)利用表位设计软件设计一段位于KLK1尾端的特异性12肽序列并采用单抗制备技术筛选出杂交瘤细胞株HTK并扩大培养杂交瘤细胞将其注入小鼠腹腔内诱生腹水并纯化出高效价、高特异性的抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体。(2)利用原核表达的方法表达并纯化人组织激肽释放酶融合蛋白(TK-4T1)。采用双抗体夹心技术和生物素-亲和素放大系统建立高效的针对人组织激肽释放酶的ELISA检测试剂盒。(3)采用病例-对照研究的方法收入1,268例脑卒中患者和1,210例正常对照,检测其血浆中人组织激肽释放酶的含量,并做5年随访研究。评估血浆中人组织激肽释放酶的含量与脑卒中及再发的关系。(4)采用横截面的病例-对照研究收入890例冠心病患者和905例正常对照。检测其血浆内人组织激肽释放酶含量并评估其与冠心病及其严重程度的关系。同时,采用判别分析和ROC曲线判定其对冠心病的临床应用价值。(5)评估了社区人群中血浆人组织激肽释放酶含量与血脂的关系。(6)评估了ACEI类药物与血浆人组织激肽释放酶的含量的关系。结果：(1)我们获得了8株可分泌抗HK的杂交瘤细胞株,命名为1A,1B8,1E4,2E4,2F8,3B7,4D5,4E2。纯化后的2F8具有较高的效价(1：25600)。经12% SDS-PAGE和Western blotting证实,该单克隆抗体制备成功并具有较高的纯度。(2)表达的融合蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示,大约在55KD处有一条浓染的新增蛋白条带。经Western bloting鉴定,能与人组织激肽释放酶单克隆抗体发生强阳性反应,HK-4T1融合蛋白具有较强的免疫原性。生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法的结果提示：以0.5ug/ml,0.25 ug/ml,0.125 ug/ml,0.062 ug/ml,0.031 ug/ml, 0.016 ug/ml,0.008 ug/ml为横坐标,其对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线,其线性关系良好(r=0.9987)。利用此试剂盒检测了124例正常人的血浆中HK1的含量,每组做三个复孔,间隔6个月后再重复一次。其组内差异为1.7%,组间差异为8%。正常人的HK1的血浆含量为252±93 ng/ml。(3)脑卒中患者血浆中人组织激肽释放酶的含量明显低于对照组(0.163±0.064 mg/l versus 0.252±0.093 mg/l, P<0.001),并且其与脑卒中的发病率及5年无事件生存率呈剂量依赖性的负相关关系。服用阿司匹林的脑卒中患者其血浆中人组织激肽释放酶的含量高于对照组(0.172±0.064 mg／lvs.0.162±0.065 mg／l,P=0.003)。(4)冠心病患者血浆中人组织激肽释放酶的含量明显高于对照组(0.347±.082 versus 0.256±0.087 mg/L, P<0.001)。升高的血浆人组织激肽释放酶的含量与冠心病呈正相关关系,而与其严重程度呈负相关关系。(5)血浆人组织激肽释放酶的含量与高密度脂蛋白(HDL)成正相关关系(r=0.069,P=0.003),与低密度脂蛋白(LDL)成负相关关系(r=-0.051,P=0.030)。(6)ACEI能明显提高冠心病患者血浆人组织激肽释放酶水平(0.388±0.076 mg/l vs. 0.320±0.079 mg/l, P<0.001; OR=3.20,95%CI 2.59-3.95, P<0.001)。结论：我们首先成功制备了人组织激肽释放酶的单克隆抗体和ELISA试剂盒。然后,本研究证明了降低的血浆人组织激肽释放酶含量具有较高的脑卒中发生率和再发率。升高的血浆人组织激肽释放酶含量与冠心病发生呈正相关关系而与冠心病的严重程度呈负相关关系。因此,人组织激肽释放酶可能具有重要的心脑血管保护作用,其在血浆中含量的可能预测脑卒中及冠心病的发生及再发。同时,人组织激肽释放酶与心脑血管疾病的传统危险因素之间存在一定的联系,尤其是其与血脂代谢的关系较为密切。