【摘 要】
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目的:胰腺癌的早期转移导致了胰腺癌的高死亡率。胰腺癌独特的免疫抑制微环境与胰腺癌的转移密切相关,并且单独使用免疫检查点抑制剂进行免疫治疗的效果差。TNFSF9表达于抗原提呈细胞和肿瘤细胞上,其反向信号传导的阻断可以重塑肿瘤免疫微环境。因此,深入探索TNFSF9对胰腺癌免疫微环境的调控及对胰腺癌转移的影响,可望揭示TNFSF9作为一种新的生物标志物为胰腺癌的免疫治疗提供更大的临床益处。方法:（1）T
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目的:胰腺癌的早期转移导致了胰腺癌的高死亡率。胰腺癌独特的免疫抑制微环境与胰腺癌的转移密切相关,并且单独使用免疫检查点抑制剂进行免疫治疗的效果差。TNFSF9表达于抗原提呈细胞和肿瘤细胞上,其反向信号传导的阻断可以重塑肿瘤免疫微环境。因此,深入探索TNFSF9对胰腺癌免疫微环境的调控及对胰腺癌转移的影响,可望揭示TNFSF9作为一种新的生物标志物为胰腺癌的免疫治疗提供更大的临床益处。方法:（1）TCGA数据库及免疫组化实验分析胰腺癌及癌旁非肿瘤组织中TNFSF9的表达水平,以及TNFSF9的表达与患者临床病理特征的关系。（2）Kaplan-Meier plotter分析胰腺癌TNFSF9的表达与患者预后的关系。（3）免疫荧光实验分析胰腺癌组织及癌旁非肿瘤组织中巨噬细胞、树突状细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润丰度,以及TNFSF9主要表达的细胞。（4）免疫荧光实验分析胰腺癌组织中M0、M1和M2极化巨噬细胞浸润的丰度,以及TNFSF9与这些细胞的相关性。（5）构建TNFSF9敲减的巨噬细胞,q RT-PCR及细胞免疫荧光实验检测TNFSF9对巨噬细胞极化的影响。Western blot实验检测巨噬细胞中TNFSF9对其下游通路Src/FAK的激活。（6）将稳定转染TNFSF9敲减病毒的巨噬细胞与胰腺癌细胞共培养,通过CCK8和单细胞克隆实验检测TNFSF9对胰腺癌细胞增殖的影响,流式细胞术检测TNFSF9对胰腺癌细胞凋亡的影响,Transwell实验检测TNFSF9对胰腺癌细胞迁移侵袭的影响。（7）QRT-PCR及Western blot实验检测胰腺癌细胞和正常胰腺细胞中TNFSF9的表达。（8）构建TNFSF9敲减的胰腺癌细胞,通过CCK8、单细胞克隆、流式细胞术、划痕和Transwell实验分别检测TNFSF9对胰腺癌细胞增殖、凋亡和迁移侵袭的影响。（9）将TNFSF9敲减的胰腺癌细胞注入裸鼠脾脏构建转移模型,检测TNFSF9在体内对胰腺癌转移的影响。（10）Western blot检测胰腺癌细胞中TNFSF9通过激活Wnt/Snail信号对胰腺癌转移的影响,以及加入Wnt激动剂对胰腺癌转移的逆转作用。（11）QRT-PCR检测TNFSF9是否改变肿瘤细胞IL-10、IL-4和TGF-β的表达,以及加入Wnt激动剂是否对这些细胞因子的表达产生影响。（12）ELISA检测TNFSF9是否改变胰腺癌细胞IL-10和TGF-β的分泌,以及加入Wnt激动剂是否对这些细胞因子的分泌产生影响。（13）将敲减TNFSF9的胰腺癌细胞与巨噬细胞共培养,通过q RT-PCR检测巨噬细胞M1极化和M2极化标记物的表达。（14）Transwell实验检测（13）中M2极化的巨噬细胞对胰腺癌细胞迁移的影响,以及TGF-β在其中的作用。结果:（1）胰腺癌组织中TNFSF9的表达高于癌旁非肿瘤组织,且与淋巴结的转移正相关。（2）胰腺癌组织中TNFSF9的高表达提示胰腺癌患者的不良预后,且在胰腺癌中具有特异性。（3）胰腺癌中巨噬细胞浸润增多,CD8+T细胞浸润减少,且TNFSF9主要表达于免疫细胞上。（4）巨噬细胞中的TNFSF9通过激活Src/FAK/p-AKT/IL-1β信号促进巨噬细胞M2极化。（5）（4）中M2极化的巨噬细胞促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移。（6）TNFSF9在胰腺癌细胞上的表达升高,促进了胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制了胰腺癌细胞的凋亡。（7）裸鼠转移模型发现TNFSF9促进胰腺癌的转移。（8）胰腺癌细胞上高表达的TNFSF9通过激活Wnt/β-catenin/Snail信号促进胰腺癌细胞的迁移。（9）胰腺癌细胞上高表达的TNFSF9通过激活Wnt信号增加IL-10和TGF-β的分泌,从而促进巨噬细胞的M2极化。（10）（9）中M2极化的巨噬细胞通过分泌TGF-β促进胰腺癌细胞的迁移。结论:在胰腺癌微环境中,不论是巨噬细胞上表达的TNFSF9还是胰腺癌细胞上表达的TNFSF9都能通过诱导巨噬细胞M2极化促进胰腺癌转移。
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