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尘螨致敏物种屋尘螨(Der p)和粉尘螨(Der f)是吸入性过敏原的主要来源,与过敏性疾病的发生呈高度相关。过敏原特异性免疫球蛋白(Ig)E的检测是诊断IgE介导的过敏性疾病的重要方法。间接IgE-ELISA方法对过敏原提取物的灵敏性受限于高IgG滴度的干扰和提取物中少量有效的过敏原组分。为了克服这些限制,我们建立了一种基于重组Der f 1/Der f 2融合蛋白(rDer f1/2)的新型Capture IgE-ELISA方法,以提高对尘螨过敏患者血清IgE检测结的灵敏性。课题组前期工作通过NGS二代测序技术完成了粉尘螨基因组和转录组测序及组装,首次发现粉尘螨细胞色素C还原酶结合蛋白(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein,UQCRB)同源物,命名为Der f 24。而屋尘螨第24组分Der p 24与粉尘螨第24组分Der f 24的同源性为97%,鉴定出Der p 24又是一主要的屋尘螨过敏原组份。世界卫生组织和国际免疫学会联合会(WHO/IUIS)过敏原命名小组委员将屋尘螨第24组份蛋白命名为Der p 24(http://www.allergen.org)。过敏原导致过敏的机制有很多种,像Der p 1和Der p2是通过蛋白功能导致过敏,而Der p 24是一个细胞色素化结合蛋白,它是通过其完整分子及生物学功能发挥作用,还是由无完整生物活性的短氨基酸序列的表位直接激发使机体产生特异性IgE(sIgE),并与之结合从而导致过敏发生的作用机制。通过对关键表位的鉴定对于过敏性疾病的诊断和治疗是非常重要的,为开发尘螨疫苗提供新思路。通过利用纳米孔测序技术(又称第四代测序)对粉尘螨基因数据进行测序分析,完成了高质量粉尘螨基因组图谱的组装,与数据库比对发现并鉴定了屋尘螨过敏原第37组份Der p 37(Petrotrophic like protein domain)的同源物Der f37。高质量的粉尘螨基因组图谱数据可以进一步促进针对粉尘螨物种的研究。目的:1.降低高IgG滴度的干扰,开发基于rDer f 1/2融合蛋白的Capture IgE-ELISA方法,以提高对尘螨过敏患者血清IgE检测的灵敏度,对于过敏性疾病的诊断和治疗有重要的意义;2.分析鉴定Der p 24 IgE表位,探究尘螨过敏原导致过敏发生的作用机制;3.利用纳米孔测序技术解析粉尘螨基因组图谱,进行基因组功能注释、进行线粒体组装;4.将过敏原数据库与粉尘螨基因组比对,鉴定粉尘螨新过敏原组份。方法:Der f 1/2融合蛋白过敏原性分析。1.构建pET28a(+)-Der f 1/2表达载体,原核系统表达。通过IgE-Western blot,IgE-Dot blot和间接IgE-ELISA检测rDer f 1/2融合蛋白的IgE活性;2.建立Capture IgE-ELISA方法,与间接ELISA进行比较。Der p 24 IgE表位鉴定。1.通过IgE-Western blot检测IgE结合活性。根据Der p 24的氨基酸序列,人工设计Der p 24 N端和C端相关截短蛋白的氨基酸序列,原核系统克隆表达纯化相关蛋白进行关键表位的筛选;2.体外实验通过IgE-ELISA,IgE-western blot,IgE-dot blot等多种免疫学方法鉴定表位肽与过敏患者血清IgE的结合活性;3.动物体内实验,将Der p 24关键表位肽低致敏免疫Balb/c小鼠,检测能否使小鼠产生sIgE和sIgG;验证Der p 24IgE表位肽能否促使肥大细胞释放氨基己糖苷酶;致敏动物的肺组织切片进行HE染色,比较过敏炎症反应程度。粉尘螨基因组精细图谱解析。1.人工纯化培养粉尘螨、提取粉尘螨DNA;2.对粉尘螨基因组数据进行组装,绘制基因组图谱;3.与粉尘螨基因组数据库比对发现粉尘螨新过敏原;4.原核系统表达纯化新过敏原,免疫学方法鉴定新过敏原。结果:Der f 1/2融合蛋白过敏原性分析。1.rDer f 1/2蛋白以包涵体的形式表达;与过敏患者血清反应,rDer f 1/2(24/28,85.8%)显示出比单独的rDer f1(21/28,75.0%)和rDer f 2(22/28,78.6%)有更高的IgE结合活性;2.在随机样本中(n=71),Capture IgE-ELISA(71/71,100%)比间接ELISA(68/71,95.8%)检测sIgE OD值更高(P<0.01)。Der p 24 IgE表位鉴定。1.屋尘螨Der p 24关键N端表位的确定:成功构建Der p 24截短蛋白高效表达载体,获得纯度大于95%的重组包涵体蛋白;IgE Western blot试验结果表明,重组蛋白rDer p 24、Der p 24(1-98aa)、Der p 24(1-78aa)和Der p 24(1-58aa)与尘螨过敏患者血清呈强阳性反应,而Der p 24(33-118aa)和Der p 24(21-118aa)与尘螨过敏患者血清呈阴性反应。2.体外试验验证:成功设计合成N端多肽序列,多种免疫学方法(IgE-ELISA,IgE Western blot,IgE Dot blot)表明Der p 24 N端表位肽与尘螨过敏患者血清反应显示出较强的IgE结合活性,与健康体检者血清无反应;3.动物体内实验,Der p 24 N端表位肽偶联OVA能够使小鼠体内产生高滴度的sIgE抗体,导致小鼠肺组织有明显的炎症反应,并且促使肥大细胞株RBL-2H3释放氨基己糖苷酶;4.Der p 24 N端表位肽的IgE结合活性强于单独线性Der p1和Der p 2 IgE表位的结合活性,并有显著性差异。粉尘螨基因组精细图谱解析。1.利用Nanopore技术测序组装了高质量的粉尘螨基因组图谱:(1)提取的DNA无污染物、无杂带;(2)组装质量评估软件结果显示,粉尘螨在已发表的蛛形纲中的基因和基因集质量是最高的,完整度为97.40%,ixodes scapμlaris(肩突硬蜱)为78.80%,stegodyphus mimosarum(蜘蛛)为81.20%,tetranychus urticae(二斑叶螨)为92.40%;(3)Nanopore技术和NGS技术基因集比较,nanopore基因集数目10,575,完整度95.70%,基因转录本长度3,544.04 bp,外显子数目425.85 bp;NGS基因集数目16,467,完整度84.80%,基因转录本长度2,358.56 bp,外显子数目414.37 bp;(4)对组装结果进行纠错,组装出长度为17,442 bp的线粒体序列,染色体条数更接近尘螨物种本身的水平;2.进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对,发现与屋尘螨Der p 37有76%的同源性,暂命名为Der f 37,GenBank登录号MK419030.1,鉴定出与尘螨过敏患者血清有强的IgE结合活性。结论:1.建立一种新的Capture IgE-ELISA方法,提高检测的灵敏度;2.屋尘螨过敏原第24组份Der p 24的IgE表位主要位于N端32氨基酸残基区域,该研究结果可能对尘螨过敏性疾病诊断和治疗试剂的开发具有重要的理论意义;3.通过Nanopore测序技术获得高质量粉尘螨基因组;4.筛选鉴定新的粉尘螨过敏原Der f 37。