研究背景及目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国临床上比较常见的恶性程度比较高的一种的恶性肿瘤,根据权威资料显示,在全世界范围内,肝癌患者的死亡病例大概为每年70万例左右,同时肝癌患者的新增病例为每年74万左右,这些死亡和新增的肝癌患者中大约有50%的病例都发生在我们中国。由于肝癌具有高发病率和死亡率,肝癌已经引起世界范围科学研究领域的重视,而且我们中国的肝癌发病率及死亡率也是呈现逐年上升的趋势,肝癌的死亡率目前在各种恶性肿瘤的相关死亡原因中排名都比较靠前,目前排在第2位,对我们人类的身体和心理健康都构成了严重的威胁,由此可见,肝癌目前已经成为了一个全世界范围内相当严峻的社会公共卫生问题。肝癌的发生以及其发展的生物学过程是一个相当复杂的过程。因此,我们需要深入HCC发生发展过程中的分子生物学机制,并探寻HCC发病预测、早期诊断和靶向治疗的新策略,从而达到有效地改善肝癌患者的治疗预后、延长肝癌患者生存时间的目标。如今,二代测序技术的发展速度相当的迅猛,曾经一直被科学家们认为是基因组里面的“噪音”的非编码RNA,通过近些年以来的相关研究发现,这些非编码RNA在人体的整个生命活动中发挥着十分重要的作用,所以非编码RNA目前已经在生命科学领域中迅速地成为了主要的研究热点之一。基因间长链非编码RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA)是一类转录本的长度在200-10000nt之间、不编码蛋白,但是能参与细胞内多种过程调控的RNA,这些长链非编码RNA的种类、数量、功能都不十分明确,其可以通过多种方式调控基因表达,包括与微小RNA(microRNA,miRNA)相互作用、与蛋白质等相互作用、剪切调控、外源性沉默以及遗传变异等多个方面,尤其是lincRNA可以在多个水平调控基因的表达。虽然近期通过有关的实验研究并结合相关的理论知识,都可以表明lincRNA在多种恶性肿瘤中都有着特定的调节和控制的相关机制,但是目前人们关于非编码转录本的有关研究尚处于起步的阶段,绝大部分的lincRNA都未曾被伟大的人类进行具体和深入的研究。尽管最近有关报道LncRNA HULC,CCAT1等在肝癌中发生、发展中发挥着十分重要作用,但大部分的lincRNA在肝癌中的发生和发展的临床意义以及相关的作用机制仍不是特别的清楚。所以,具体而深入的研究lincRNA的在肝癌中的相关作用机制及有关功能,将有可能成为肝癌患者的早期诊断和积极治疗,并取得良好治疗效果的新方向。本研究基于人类LncRNA公共数据库GSE55191和GSE580435,由此我们发现了基因间长链非编码RNA 524346(long non-coding RNA 524346,lincRNA524346)在肝细胞癌患者的癌组织中的表达水平相比较于癌旁组织和正常肝组织中降低比较明显。但是,lincRNA 524346在肝癌组织中的低表达是否表明着其可能具有重大的功能意义,需要我们进行进一步地深入研究。本论文的主要研究目的正是检测肝癌中的lincRNA 524346的表达情况及其相关的临床意义。首先运用qRT-PCR的具体方法对lincRNA 524346在61对行手术切除的肝癌患者(癌、癌旁)组织标本、肝癌细胞系SMMC-7721,HepG2和Huh7及肝脏正常细胞系LO2中的表达水平进行相关检测,接着将lincRNA524346的相关表达水平与肝细胞癌患者的临床病理特征间的相关性进行具体的统计分析。用受试者工作曲线(receiver operating characteristics,ROC)来评价肝癌患者的肝癌组织中lincRNA 524346的相关表达水平在肝细胞癌的早期诊断中的效能。最后,结合lincRNA 524346的表达情况与肝癌患者的无复发生存时间的关系,明确lincRNA 524346是否对肝癌患者的预后有一定的提示作用。一、材料与方法1、临床组织样本收集和细胞系本研究共纳入了61位肝细胞癌患者,61对新鲜肝癌组织(癌、癌旁)标本来自2013年12月至2015年12月期间在我院进行第一次肝癌手术R0切除的患者,手术标本在离体后迅速保存在液氮中。所有入组患者的标本在收集前均未进行包括TACE和手术等在内的任何抗肿瘤治疗,术后标本经我院的病理医生明确证实为肝细胞癌。取来自于与肝癌患者癌组织配对的癌旁组织(距离手术切缘至少3cm)作为对照组标本,这些标本的术后病理检查都未发现肝癌细胞。研究中对纳入本研究的肝癌组织的样本进行随机选择,并对这些患者进行1年以上的随访。依据Edmondson-Steiner的有关分级标准来确定肿瘤的具体分化程度,按照美国肿瘤研究联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)2010发布的第七版分期系统的相关标准来确定肿瘤的具体分期。肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2和Huh7以及正常肝细胞系LO2,由中国人民解放军第三〇二医院临床管理中心提供,均使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基作为培养基,置于37℃5%CO2的细胞培养箱中培养。2、RNA提取,逆转录及实时荧光定量PCR运用Trizol(LifeTechnologies,USA)法提取组织样本及各种细胞系中的总RNA,然后将RNA反转录成为cDNA。接着使用StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统进行实时荧光定量PCR对反转录后的cDNA进行扩增,反应内参基因为GAPDH。使用2-△△Ct相对定量方法来分析和计算相应的倍数变化。3、统计学分析采用SPSS18.0统计软件来对相关数据进行分析。非参数Wilcoxon秩和检验对lincRNA524346在配对癌旁组织、癌组织以及细胞系的相关表达水平进行有效的比较,lincRNA524346在肝癌细胞系及正常的LO2细胞中的相关表达差异采用t检验。ROC曲线来评价lincRNA524346在诊断肝细胞癌中的特异度和敏感度,同时使用ROC曲线下面积(AUC)来评价lincRNA 524346在肝细胞癌中的诊断能力;以95%为可信区间。最后利用Kaplan-Meier对肝癌患者的预后进行分析(包括无复发生存等),P<0.05表示差异具有统计学意义。二、结果2.1、lincRNA 524346在肝细胞癌患者(癌、癌旁)组织及肝癌细胞系的表达水平及ROC分析通过qRT-PCR的方法来分别检测61例肝细胞癌患者癌组织及其配对癌旁组织中lincRNA 524346的表达水平,结果表明lincRNA 524346在83.6%(51/61)肝细胞癌患者的肝癌组织中的表达水平较癌旁组织中的表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.01)。其ROC曲线下面积(AUC)为0.74(95%CI:0.6435~0.8429,P<0.0001),大于0.7,表示预测价值中等,其cut off值是0.009时,敏感性为65.12%、特异性为63.83%、约登指数为0.29,初步提示lincRNA524346在肝细胞癌的诊断中具有一定的价值。3种肝癌细胞系与正常肝细胞株LO2相比,lincRNA 524346均为低表达,差异具有统计学意义(P<0.01);其中在SMMC-7721细胞中表达水平最低。2.2、lincRNA 524346表达与HCC患者临床病理特征、预后的相关性分析通过对61位肝癌患者中lincRNA 524346的表达情况与其对应的临床病理特征信息进行相关分析,我们发现:lincRNA 524346的表达与病理分期、肿瘤数目、PVTT、肝硬化和微静脉浸润明显相关,然而与年龄、肿瘤的大小、性别、组织分化水平、血清AFP水平、饮酒以及吸烟没有明显的统计学差异。同时我们对61位肝癌患者中lincRNA 524346的表达和肝癌患者术后的复发时间的关系分析,结果发现:lincRNA 524346的表达水平与肝细胞癌患者行肝癌切除手术后的无复发生存时间有明显的关系。三、结论1、lincRNA 524346在肝细胞癌患者癌组织中的表达较配对癌旁组织相比,呈现显著低表达。2、lincRNA 524346在肝癌细胞系(SMMC-7721、HepG2和Huh7)中的表达较正常肝细胞系LO2相比为显著低表达。3、lincRNA 524346的表达水平与肝癌患者的肿瘤数目、PVTT、病理分期、肝硬化及微静脉浸润具有显著相关性。4、lincRNA 524346低表达的肝癌患者较高表达患者的预后差。5、lincRNA 524346可作为肝癌患者预后的影响因素。