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研究背景与目的据统计全世界80%-90%的人曾经受腰腿痛折磨,腰椎间盘退变、突出是最常见的病因。但其确切的发病机制尚未明确,临床治疗效果欠佳。腰椎间盘退变是下腰痛及腰椎间盘突出的主要原因之一,退变主要表现在细胞和基质成分的变化,其中基质成分的改变是椎间盘(intervertebral disc, IVD)力学特征丧失的直接原因。目前研究认为其退变的实质就是椎间盘细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解及基质与细胞粘附功能消退导致的细胞凋亡。在基质合成与降解失衡导致基质成分紊乱的过程中,基质金属蛋白质酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)作为基质降解酶发挥重要作用。组织特异性抑制剂(tissue inhibitors of Metalloproteinase, TIMP)是一种内源性的基质金属蛋白酶组织特异性抑制剂。不同的TIMPs与不同的MMPs具有选择性的亲和力。TIMPs与相应的MMPs以1:1克分子量比例形成不可逆的非共价结合而抑制其活性。MMPs/TIMPs被发现与人类椎间盘退变关系密切。一般临床腰椎间盘突出手术病人以椎间盘突出、椎间盘脱出及椎间盘游离三种类型为常见。而这三种退变突出的分型也反映了椎间盘纤维环的不同程度破损及髓核组织突出。故本研究以正常非突出椎间盘及上述三种椎间盘突出类型为研究对象。探讨MMP-9及TIMP-1与不同程度腰椎间盘退变突出发病之间的关系。方法收集2005年3月～2006年4月间第三军医大学西南医院骨科行腰椎间盘突出症手术切除的髓核标本45例。根据椎间盘退变突出的程度将标本分组:椎间盘突出组,椎间盘脱出组,椎间盘游离组,每组各15例。以15例非突出椎间盘髓核标本为正常对照,用RT-PCR反应检测各椎间盘突出组与正常组的MMP-9及TIMP-1的mRNA表达;用Western blot检测上述各MMP-9及TIMP-1蛋白的表达;采用明胶酶谱法定量检测与分析MMP-9及TIMP-1的活性。最后用计算机图像处理,测定各个条带的灰度值,以目的基因与内参照的灰度面积比值为半定量资料,进行统计分析。结果1. RT-PCR结果显示,正常和不同程度退变突出椎间盘髓核MMP-9及TIMP-1均有一定程度的mRNA表达,其与β-actin比较的相对含量均值见表1。MMP-9及TIMP-1均随着椎间盘突出程度加重而升高, MMP-9 mRNA在突出、脱出及游离组的表达分别较正常组升高156%、188%及230%,各组间相比较有显著差异(P<0.01)。TIMP-1随椎间盘退变突出程度升高较MMP-9稍低,分别为正常组的137%、163%和192%,各组间相比较有显著差异(P<0.01)。RT-PCR mRNA的表达MMP-9/TIMP-1随着椎间盘突出程度加重而分别升高117%、121%和123%,各组间相比较无明显差异(P≥0.05)。2. Western blot印迹图像分析结果显示,正常和不同程度退变突出椎间盘髓核MMP-9及TIMP-1均有一定程度的表达,MMP-9蛋白吸光度值在突出、脱出及游离组的表达分别较正常组升高134%、145%及158%,各组间相比较有显著差异(P<0.01)。TIMP-1随椎间盘退变突出程度升高较MMP-9稍低,分别为正常组的123%、141%和152%,各组间相比较有显著差异(P<0.01)。RT-PCR mRNA的表达MMP-9/TIMP-1随着椎间盘突出程度加重而分别升高108%、109%和120%,各组间相比较无明显差异(P≥0.05)。3.明胶酶谱图像分析结果显示,正常及不同程度退变突出腰椎间髓核组织中MMP-9及TIMP-1均有一定程度表达,MMP-9为92KD酶原和82KD两种形式表达,TIMP-1为28KD分子量蛋白。MMP-9蛋白吸光度值在突出、脱出及游离组的表达分别较正常组升高183%、292%及379%,各组间相比较有显著差异(P<0.01)。TIMP-1在各椎间盘退变突出组中较正常组升高,分别为正常组的164%、178%和217%,各组间相比较有显著差异(P<0.01)。RT-PCR mRNA的表达MMP-9/TIMP-1随着椎间盘突出程度加重而分别升高131%、171%和218%,各组间相比较具有显著性差异(P<0.01)。结论1. MMP-9在正常及退变突出腰椎间盘髓核组织中的基因、蛋白均有一定表达,其表达程度及酶活性随腰椎间盘退变突出程度加重而升高。MMP-9与腰椎间盘退变突出关系密切。2. TIMP-1在正常及退变突出腰椎间盘髓核组织中的基因、蛋白均有一定表达,且表达程度随腰椎间盘退变突出程度加重而升高,其在退变突出腰椎间盘中的酶活性较正常升高,但在不同程度退变突出组间无差异。3.在不同程度退变突腰椎间盘髓核组织的基因、蛋白检测中,MMP-9与TIMP-1的比值均在各腰椎间盘退变突出组中较正常组升高,但各退变突出组间无显著差异。酶活性检测中MMP-9/TIMP-1比值变化随腰椎间盘退变突出程度加重而升高,提示TIMP-1与MMP-9间形成不可逆共价结合而丧失活性,但MMP-9随椎间盘退变突出程度加重较TIMP-1高表达,导致MMP-9/TIMP-1比值升高。提示二者比值失调与椎间盘退变突出程度关系密切。综上所述,我们从基因、蛋白表达及酶活性三个水平检测了MMP-9及TIMP-1,并分析MMP-9/TIMP-1比值与不同程度腰椎间盘退变突出间的关系。证实MMP-9随腰椎间盘退变突出程度加重表达增高,且MMP-9与TIMP-1比值亦随腰椎间盘退变突出程度加重升高。提示MMP-9可能通过降解椎间盘基质导致其退变突出,TIMP-1与MMP-9表达失衡与椎间盘退变突出密切相关。