论文部分内容阅读
背景和目的尽管广谱抗菌素广泛应用,细菌感染仍是住院病人死亡的主要原因。细菌及其产物会激活单核巨噬细胞系统释放大量炎症介质,引起内毒素血症和多脏器功能衰竭。阻断这些炎症介质的生物学效应可降低感染急性期死亡率。目前发现机体通过细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和细胞内的NODs受体识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),引起免疫炎症反应。RIP2是信号转导途径中关键的丝氨酸/苏氨酸激酶,是TLRs及NODs信号通路的下游因子,RIP2缺陷的巨噬细胞予LPS刺激后NF-κB激活下降,炎症细胞因子如TNF-α等产生明显减少,RIP2缺陷的小鼠能抵御内毒素的致死效应;而NODs通过募集RIP2激活NF-κB,RIP2显性失活可抑制巨噬细胞NOD1介导的NF-κB激活。故RIP2在介导TLRs和NODs的信号级联反应中起重要作用,引起宿主的天然和获得性免疫反应,激活NF-κB并产生炎症细胞因子。本课题应用RNA干扰技术阻断巨噬细胞RIP2的表达,研究其对巨噬细胞产生细胞因子的影响及其对小鼠内毒素血症的保护效应。方法应用重组DNA技术和pRNAT-U6.1载体构建小鼠RIP2的siRNA真核表达质粒并测序。转染巨噬细胞株RAW264.7后用RT-PCR和Western blot方法检测细胞RIP2的mRNA和蛋白表达,MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率;不同浓度LPS刺激不同时间后,用ELISA法测定细胞TNF-α,半定量Western测定HMGB1的水平。RIP2 siRNA表达质粒经小鼠尾静脉注射后,予LPS腹腔注射刺激小鼠,观察小鼠死亡率,用RT-PCR方法检测肝组织RIP2mRNA表达,Western blot方法检测肝组织RIP2和HMGB1的蛋白表达,ELISA法测定血清TNF-α的水平。结果1、构建的RIP2 siRNA表达质粒的序列与我们设计的一致。2、RIP2 siRNA质粒转染后,细胞内出现绿色荧光,证实质粒己成功转入细胞。3、Ⅲ号质粒转染组细胞RIP2mRNA和蛋白表达减少,细胞增殖较空白质粒、Ⅰ号质粒和Ⅱ号质粒转染组明显增加而细胞凋亡减少;予LPS刺激后Ⅲ号质粒转染组的TNF-α、HMGB1浓度较其它组减少。4、RIP2表达质粒体内转染后,Ⅲ号质粒转染组内毒素血症小鼠的生存率较其它组高,而肝组织RIP2mRNA和蛋白表达较低,HMGB1蛋白表达较其它组减少,血清TNF-α浓度(300.43±59.26pg/ml)较其它组低。结论RIP2siRNA功能片段在体外和体内均可抑制RIP2 mRNA和蛋白表达,减少LPS刺激后TNF-α和HMGB1的分泌和表达,提高内毒素血症小鼠的生存率,为临床救治败血症提供新的线索。