乏氧为实体肿瘤中较普遍的现象和微环境最重要的特征之一，包括急性乏氧和慢性乏氧，其产生主要与与肿瘤无限制生长、氧耗增加、血供不足及肿瘤组织血管发育不良等有关。研究表明，乏氧与肿瘤放射治疗抵抗、药物抵抗及不良预后密切相关，其中乏氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）作为最重要的转录因子，可介导多种包括与促血管生成、糖酵解、抗凋亡等基因的表达，阻断其信号传导途径成为目前靶向治疗的热点。由于肿瘤内部存在着复杂的微环境-基因的交互作用，HIF-1α作为克服乏氧所致的放、化疗抵抗的靶点是否依赖于肿瘤的基因背景尚不清楚。特别是近年来，研究表明HIF-1α和p53存在着重要的交互作用，由于HIF-1α见于70％以上的肿瘤原发及转移病灶，p53突变见于50％以上的肿瘤，HIF-1α与不同功能状态的p53之间的相互作用其潜在的病理生理学意义应具有普遍性，对肿瘤HIF-1α靶点治疗的影响意义重大。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亚基构成的异二聚体。HIF-1β，又称为芳烃受体核转位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），在正常与乏氧情况下均持续表达。HIF-1作用主要由HIF-1α的表达和活性决定的，其调控主要发生在转录后蛋白水平上，受到微环境中氧浓度的精细调控。正常氧分压下，HIF-1α与抑癌基因VHL（von Hippel-lindau）结合，通过泛素蛋白酶途径被迅速降解，半衰期仅有5mins，故可作为急性乏氧标记物。而乏氧状态下，HIF-1α蛋白表达显著增加，降解被阻断，与HIF-1β结合形成HIF-1，并被转移入细胞核内，调控下游基因的表达。尽管临床资料显示HIF-1α表达与实体肿瘤不良预后、放化疗抵抗有关，但目前对HIF-1α在肿瘤放、化疗抵抗中是否及如何发挥作用结论不一致，体外实验选择的细胞株p53状态不同可能是其中一重要因素。目前仅Moller的研究探讨了HIF-1表达下调对放疗敏感性的影响与p53的关系，结果表明抑制HIF-1可降低而不是提高体外放射敏感性，且该作用依赖于p53正常功能状态。相反，p53表达缺失的细胞株HIF-1的表达与放射敏感性无关。MEF细胞转导入H-ras与SV40大Tag后获得不死性，同时p53失活，推测可能与Arvold等人的研究结果有关。Sumiyoshi等在胃癌患者中的研究进一步表明了HIF-1与p53交互作用对治疗的重要影响，HIF-1表达与突变型p53同时存在的胃癌患者预后最差，上述结论仍需要进一步扩大验证。另外，相对于p53缺失型和野生型，p53突变型细胞中HIF-1的表达下调是否影响细胞的放、化疗敏感性及可能的机制也不清楚。目前关于HIF-1与p53的交互作用研究仍主要集中在蛋白分子相互作用、细胞周期、调亡及对下游信号通路中靶基因调控上。p53突变与细胞的恶性表型密切相关，HIF1可增强该作用。乏氧状态下，HIF-1可通过结合Mdm2，抑制p53降解，调节细胞内p53表达，在乏氧导致的细胞凋亡中起重要作用。换句话说，HIF-1促凋亡作用至少部分由p53介导的。反过来，p53表达可抑制HIF-1转录活性和下游基因表达。另外，在乏氧所致的细胞周期停滞中，HIF-1与p53同时缺失情况下，细胞周期完全不受外界微环境如乏氧的调控。关于两者交互作用对肿瘤患者预后、放、化疗敏感性影响的临床资料很少。因此，本课题立足于肿瘤基因与微环境的相互作用，特别是HIF-1α与p53存在着重要的交互作用，选择同基因细胞株人纤维肉瘤细胞，p53野生型HT1080及突变型HT1080-6TG，着重探讨以下两个关键问题：1．HIF-1α作为克服乏氧所致放、化疗抵抗的靶点，其作用是否依赖于细胞不同的p53状态?进而为寻找适合HIF-1分子靶向治疗的肿瘤患者打下理论基础。2．．探讨HIF-1α与p53交互作用对肿瘤放化疗敏感性产生影响的分子机制。第一部分慢病毒介导的同基因细胞株HT1080与HT1080-6TG的HIF-1α基因表达沉默1材料与方法1．1细胞株：HT1080（p53野生型），HT1080-6TG（p53突变型）。1．2 HIF-1αRNA干扰慢病毒载体的构建：采用Invitrogen公司的BLOCK—iT Lentiviral RNAiExpression System，构建入门克隆和病毒包装目的质粒。1．3 RNA干扰慢病毒的生产和滴度测定：四种质粒共转染293FT的方式生产病毒，病毒功能滴度测定用转导试验。1．4基因稳定沉默细胞株的筛选：慢病毒转导HT1080和HT1080-6TG细胞后用Blasticidin筛选，建立HIF-1α基因沉默细胞株。1．5 HIF-1αmRNA表达水平的分析：荧光定量RT-PCR。1．6 HIF-1α蛋白表达水平的检测：Western Blot分析。1．7乏氧处理：三气培养箱调整氧浓度至0.5％，24h。1．8细胞生长增殖测定：Typhan blue染色细胞计数法。2结果2．1成功构建HIF-1αRNAi慢病毒载体（lenti6-HIF1α），其转导HT1080与HT1080-6TG的功能低度分别为：7.43×10⁵TU／ml和6.27×10⁵TU／ml。2．2成功构建HIF-1α基因沉默的细胞株，HT1080／HIF1α（-）与HT1080-6TG／HIF1α（-）。2．3 HT1080／HIF1α（-）与HT1080-6TG／HIF1α（-）常氧状态下，HIF-1αmRNA水平分别下降86.7％和84.4％；乏氧状态下分别下降91.6％和97.3％。2．4 HT1080／HIF1α（-）与HT1080-6TG／HIF1α（-），常氧状态下HIF-1α蛋白质水平较亲代细胞无明显差异，而乏氧状态下分别下降84.7％和96.2％。2．5 HT1080、HT1080-6TG、HT1080／HIF1α（-）和HT1080-6TG／HIF1α（-），常氧状态下，细胞生长倍增时间分别为25.96h，26.35hrs，26.34h和24.15h。乏氧状态下，HT1080、HT1080-6TG、HT1080／HIF1α（-）均表现出生长受抑，而HT1080-6TG／HIF1α（-）仍可低速生长。3结论3．1采用BLOCK-iT慢病毒RNA干扰系统，成功构建HIF1αsiRNA的慢病毒载体。3．2应用病毒转导与Blasticidin筛选的方式，成功建立HIF1α基因稳定沉默HT1080与HT1080-6TG，HIF1α无论在mRNA水平或蛋白水平均明显下降。3．3常氧状态下，HIF-1α基因沉默对于细胞生长无明显影响。3．4乏氧状态下，HIF-1α表达下调与p53突变同时存在时，表现出生长抑制抵抗。第二部分HIF-1α基因表达沉默对乏氧所致的肿瘤放、化疗抵抗的影响及与p53功能状态的相关性1材料与方法1．1药物敏感性实验：采用MTT评价对DDP和VP-16的敏感性，根据IC₅₀值计算各种细胞乏氧抵抗的OER（oxygen enhancement ratio）值。乏氧组：细胞在乏氧4h后加入药物，然后在乏氧环境中继续作用24h。1．2放射敏感性实验：采用克隆形成实验评价细胞对X射线的敏感性，剂量效应曲线根据放射的线性平方方程（linear-quadratic equation）拟合，并计算OER值。乏氧组：细胞在乏氧24h后，再氧合30min内接受放疗。1．3乏氧处理：三气培养箱调整氧浓度至0.5％和1.0％。2结果2．1 HT1080和HT1080-6TG亲代细胞，无论对DDP还是VP-16均表现出乏氧相关的药物抵抗。2．2乏氧所致药物抵抗程度表现出氧浓度依赖性。当氧浓度为0.5％时，DDP抵抗OER值，在HT1080与HT1080-6TG分别为2.47±0.26和1.72±0.02；当氧浓度为1.0％时，分别为1.87±0.13和1.184±0.11，P＜0.05。2．3乏氧所致DDP抵抗程度表现出p53功能状态依赖性。当氧浓度为0.5％时，DDP抵抗OER（oxygen enhancement ratio）值，HT1080为2.47±0.26，HT1080-6TG为1.72±0.02，P＜0.05。2．4乏氧所致VP-16抵抗程度无p53功能状态依赖性。当氧浓度为0.5％时，VP-16抵抗OER，HT1080为2.09±0.51，HT1080-6TG为1.71±0.42，P＞0.05。2．5 HIF-1α基因沉默可克服HT1080对乏氧所致的DDP抵抗，而对VP-16抵抗无明显作用。当氧浓度为0.5％时，乏氧所致DDP抵抗的OER在HT1080／HIF1α（-）为1.47±0.33，与HT1080比较，P＜0.05。2．6 HIF-1α基因沉默对HT1080-6TG乏氧所致的DDP、VP-16抵抗均无明显作用。2．7 HT1080和HT1080-6TG亲代细胞经过乏氧处理后，对X射线的敏感性显著下降，OER分别为1.24和1.23。2．8经过乏氧处理后，HT1080／HIF1α（-）对X射线的敏感性显著升高，OER为0.75；而HT1080-6TG／HIF1α（-）仍表现出放疗抵抗，OER为1.16。3结论3．1乏氧所致药物抵抗程度表现出氧浓度、药物和p53功能状态依赖性。3．2 HIF1α基因沉默逆转乏氧诱导的放、化疗抵抗的作用依赖于正常的p53功能状态。第三部分HIF-1α基因表达沉默逆转乏氧诱导的放化疗抵抗的机制研究1材料与方法1．1细胞周期分析：用流式细胞技术测定细胞DNA含量，Modtif软件分析细胞周期。1．2细胞凋亡实验：采用Annexin-V／PI和Caspase 3染色流式细胞仪分析。1．3 HIF-1α和p53下游通路蛋白表达：p53、Phospho-p53（Ser15）、p21、Bid、Bax和Bcl-2采用Western blotting。2结果2．1乏氧24h（0.5％氧浓度），HT1080和HT1080-6TG亲代细胞均表现出周期停滞，G1期增加，S期减少。而该作用在HIF-1α基因沉默细胞均较亲代细胞减弱，特别是HT1080-6TG／HIF1α（-）该作用最弱。2．2乏氧24h（0.5％氧浓度），HT1080和HT1080-6TG亲代细胞与HIF-1α基因沉默细胞凋亡无显著性差异；但当与DDP（20μM）共同作用时，4组细胞的凋亡均显著增加。与常氧组比较，乏氧可显著减少DDP导致的凋亡，该作用在HT1080、HT1080-6TG、HT1080-6TG／HIF1α（-）明显，而HT1080／HIF1α（-）常、乏氧状态下DDP作用后的凋亡无显著性差异。2．3常氧状态下，仅Bcl-2在HIF-1α基因沉默的细胞中较亲代细胞表达减少，p53、Phospho-p53（Ser15）、p21、Bid及Bax在4组细胞中无显著性差别。乏氧状态下，p53和Bcl-2表达较常氧组无显著性变化；乏氧后p21表达增加可见于HT1080和HT1080-6TG亲代细胞，以HT1080更显著，而HIF-1α基因沉默细胞无表达；HIF-1α基因沉默可导致HT1080乏氧后Bid显著增加，而HT1080-6TG细胞Bid仅轻度增加；乏氧后bax表达较常氧组均增加，HT1080／HIF1α（-）较HT1080增加更显著，相比较，HT1080-6TG／HIF1α（-）反而较HT1080-6TG表达减少。3结论3．1 HIF-1α与p53共同参与乏氧所致的细胞周期停滞作用，HIF-1α表达下调与p53失功能状态同时存在时，细胞周期停滞作用明显减弱。3．2乏氧可抵抗抗肿瘤药物引起的凋亡。HIF-1α基因沉默可克服乏氧的凋亡抵抗，而且该作用依赖于正常的p53状态。3．2 HIF-1α与p53共同参与了下游信号通路蛋白的表达，如p21、bax、bid、bcl-2等，并可能与乏氧所致的放、化疗抵抗有关。