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目的:研究发现,滤泡淋巴瘤(FL)患者初诊时骨髓受累的比例近40%-70%,骨髓受累的FL患者预后极差。FL肿瘤细胞与骨髓微环境各组分直接接触并相互作用,进一步影响彼此的生物学行为。前期研究提示,骨髓成骨龛与FL肿瘤微环境FDC网具有一定的生物学共性,通过骨髓微环境的基质细胞成骨细胞(OB)与FL肿瘤细胞接触性共培养,OB对FL肿瘤细胞的迁移、粘附与增殖有着重要的作用,深入研究FL骨髓受累的机制,对靶向治疗FL骨髓受累及FL复发患者有积极的意义。本研究对FL肿瘤细胞和成骨龛间的粘附作用机制进行了初步的探讨,并对FL肿瘤细胞和OB的粘附进行人工干预,寻找参与FL骨髓受累的分子靶点,为靶向治疗骨髓受累FL患者寻找新的切入点。方法:建立FL肿瘤细胞系(DOHH2)和OB体外接触性共培养体系,应用流式分析技术(FC)分析两者相关粘附分子(CXCR4、ICAM-1、OB-cadherin和CD44)的表达情况并分析在OB与DOHH2共培养前后粘附分子的平均荧光强度(MFI)的变化,初步筛选OB与DOHH2相互粘附的作用分子;随后利用荧光实时定量PCR(RT-q PCR)技术检测OB和DOHH2共培养前后相关粘附分子(CXCR4、OB-cadherin、OPN、OCN和SDF-1)基因的变化及蛋白质印迹法(Western blot)半定量技术检测粘附分子(CXCR4、OB-cadherin和OPN)蛋白水平的变化、ELISA实验技术检测相关粘附分子(OCN和SDF-1)分泌水平的变化,得出参与OB与DOHH2粘附的相关分子,进一步观察靶向阻断CXCR4、ICAM-1后对DOHH2增殖和粘附的影响,分析结果,得出结论。结果:1(1)FC检测DOHH2表面CXCR4的阳性率为100%,与OB共培养48h后,CXCR4的阳性率未改变,但其MFI降低(61.43±4.35)%,变化显著(P<0.05);(2)FC检测DOHH2表面粘附分子ICAM-1的阳性率约100%,与OB共培养48h后,DOHH2表达ICAM-1的阳性率未改变,其MFI增加(36.71±1.56)%,具有明显的变化(P<0.05);(3)FC检测显示与DOHH2共培养前后,OB表面ICAM-1的阳性率均约为88%,ICAM-1的MFI增加了(13.37±13.05)%,但无统计学意义(P>0.05);(4)FC检测示OB表面OB-cadherin阳性率(54.33±4.80)%,与DOHH2共培养后,OB表面OB-cadherin阳性率增加了(41.93±4.74)%及MFI增加170.67±20.50,均具有统计学意义(P<0.05);(5)FC检测OB表面分子CD44的表达率为100%,与DOHH2共培养后,CD44的阳性率与MFI均无明显变化(P>0.05);2(1)RT-q PCR检测24h和36h共培养组(OB和DOHH2)CXCR4m RNA是对照组(DOHH2)的(0.472±0.03)倍和(0.48±0.09)倍,CXCR4表达下调(P<0.05);(2)RT-q PCR检测24h共培养组OB-cadherinm RNA是对照组(OB)的(1.183±0.17)倍,没有明显差异(P>0.05),但36h共培养组OB-cadherinm RNA是对照组的(9.019±1.54)倍,OB-cadherin表达上调(P<0.05);(3)与DOHH2共培养24h和36h后,OB表达OPNm RNA是OB组的(1.757±0.07)倍和(2.288±0.28)倍,OPN表达上调(P<0.05);(4)OB与DOHH2共培养24h后,OB表达OCNm RNA是OB组的(1.576±0.30)倍,统计学上无明显差异(P>0.05),但共培养36h后,共培养组是OB组的(2.578±0.31)倍,统计学上有明显差异(P<0.05);(5)共培养24h和36h后,RT-q PCR检测SDF-1m RNA的水平,共培养组是OB对照组的(1.204±0.24)倍和(1.711±0.34)倍,无明显差异(P>0.05);3(1)Western blot检测12h、24h和36h DOHH2组的CXCR4表达,OB和DOHH2组CXCR4/β-actin的比值比DOHH2组分别降低(48.322±5.8)%、(36.136±2.90)%和(40.910±5.87)%,提示DOHH2与OB共培养后,DOHH2表面分子CXCR4的表达明显降低,统计学上具有显著差异,但无时间依赖性(P<0.05);(2)Western blot检测12h、24h和36h的OB组和共培养组的OB-cadherin表达,共培养组OB-cadherin/β-actin的灰度比值比OB组分别增加(46.312±8.13)%、(9.181±2.50)%和(28.730±6.76)%,统计学上具有显著差异(P<0.05);(3)Western blot检测12h、24h和36h的OB组和共培养组的OPN表达,共培养组OPN/β-actin的灰度比值比OB组分别增加(-5.50±5.39)%、(20.630±5.77)%和(42.870±9.86)%,与DOHH2共培养24h和36h后,OB表达OPN明显升高,统计学上具有显著差异(P<0.05);4(1)ELISA检测12h、24h及36h OB单独培养组的OCN的浓度分别为(291.879±17.43)ng/L,(305.605±20.06)ng/L和(440.315±22.74)ng/L,而共培养组的OCN浓度分别为(330.626±26.38)ng/L,(370.227±30.08)ng/L和(487.160±33.76)ng/L,共培养组分泌OCN的浓度明显升高(P<0.05);(2)ELISA检测24h、36h及72h OB组的SDF-1的浓度分别为(580.156±58.03)ng/L,(594.520±32.10)ng/L和(597.133±30.66)ng/L,共培养组的SDF-1浓度分别为(601.868±54.11)ng/L,(575.012±45.33)ng/L和(566.716±37.05)ng/L,经统计分析,OB与DOHH2共培养前后OB分泌的SDF-1无明显变化(P>0.05)。5(1)靶向阻断DOHH2表面分子CXCR4表达24h后,CCK8法检测实验组(OB+DOHH2+anti-CXCR4抗体)的DOHH2增殖率比对照组(OB+DOHH2)增加(0.0369±0.45)倍,实验组(OB+DOHH2+anti-ICAM-1抗体)DOHH2的增殖率比对照组(OB+DOHH2)降低(0.0156±0.11)倍,DOHH2的增殖率无明显改变(P>0.05);(2)anti-CXCR4阻断DOHH2表面分子CXCR4后,对照组粘附率为(43±1.00)%,实验组(OB+DOHH2+anti-CXCR4抗体)粘附率为(12±0.80)%,DOHH2粘附率降低了约31%;实验组(OB+DOHH2+anti-ICAM-1抗体)的粘附率为(9±0.60)%,OB与DOHH2的粘附率降低了34%,均具有显著性统计学差异((P<0.05);结论1 DOHH2通过上调ICAM-1及下调CXCR4的表达促进其与OB之间的粘附;2 OB通过上调OPN、OB-cadherin的表达及增加OCN的分泌促进与DOHH2之间的粘附;3 CXCR4与ICAM-1参与OB与DOHH2的相互粘附过程,但是不参与OB促DOHH2增殖的过程。