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蜜蜂白垩病是一种由真菌蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)寄生而引起蜜蜂幼虫死亡的传染性疾病,对蜂群的群势发展影响极大,在近几年又呈现出大面积爆发的趋势,成为当前我国危害西方蜜蜂最为严重的蜜蜂疾病。目前蜜蜂白垩病的诊断方法主要依赖于典型症状和蜜蜂球囊菌的形态学特征,费时费力且不够准确,同时难以在发病初期做出准确诊断。本文通过参照GenBank数据库里收录的所列Ascosphaera属20个物种的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA区段序列资料,根据各序列间的保守区段序列和变化区段序列设计A. apis种的高特异性引物,利用PCR方法体外扩增出可作为检测A. apis的分子标记的DNA片断,作为诊断蜜蜂白垩病的分子标记,并深入研究该分子标记特异性、灵敏性和适用性。研究结果如下:(1)成功克隆A. apis的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA区段序列内一个442 bp的特异片段,该DNA片段可以作为蜜蜂白垩病的诊断分子标记。(2)利用该分子标记分别检测意大利蜜蜂幼虫、中华蜜蜂幼虫、毛霉(Mucor racemosus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、啤酒酵母(Saccharomyces ceravisiae)、大肠杆菌(E. coli)和蜜蜂球囊菌等7种DNA样品,结果发现仅有作为对照的A. apis样品能成功地扩增出400~500 bp的单一条带;从病虫尸体分离的毛霉和黄曲霉、啤酒酵母、大肠杆菌、健康蜜蜂幼虫的DNA样品均不能扩增出相关产物。这说明该诊断分子标记不会受到其他杂菌和蜜蜂DNA的干扰,对A. apis具有较高特异性。(3)通过将A. apis的DNA母液作一系列浓度梯度稀释,测定出该诊断分子标记的最低检测A. apis DNA模板浓度为1.74×10-7 ng·μL-1,即在25μL的PCR反应体系中加入4.34×10-6 ng的A. apis的DNA样品,检测结果即可呈阳性,可见该诊断分子标记的灵敏性是相当高的。(4)利用该诊断分子标记对取自不同蜂群且患病死亡的未经分离纯化培养的蜜蜂幼虫虫尸、无症状蜜蜂幼虫直接进行A. apis检测。结果表明,利用该诊断分子标记可以准确地直接从罹患白垩病死亡蜜蜂幼虫尸体检测出A. apis,不需要经过病原菌的分离纯化培养,具有方便、快捷、准确的特点。同时,该诊断分子标记还可以检测出无症状蜜蜂幼虫体内的病原物A. apis,说明该诊断分子标记完全不依赖于症状,可望用于蜂群无典型症状或症状不易发现的发病初期或处于潜伏期的病原检测,对于蜜蜂白垩病的预防工作有着积极的应用价值。(5)根据上述一系列基础研究,可以构建出一套以PCR为基础蜜蜂白垩病分子诊断技术,该分子诊断技术具有准确、灵敏和快捷的特点,完全不依赖于典型症状,所以可用于蜂群无典型症状或症状不易发现的发病初期或处于潜伏期的病原检测。(6)利用本研究构建的蜜蜂白垩病分子诊断技术对所采集到的中华蜜蜂疑似患白垩病虫尸进行病原鉴定和诊断,结果证明本研究从中华蜜蜂虫尸上所分离培养的病原真菌菌株为A. apis,说明所采集的中华蜜蜂虫尸即为A. apis感染罹患蜜蜂白垩病死亡的雄蜂幼虫。这将是首例发现中华蜜蜂罹患白垩病的报道。