[目的]探索并寻找一种可应用于临床的靶向治疗方法,来抑制移植器官的慢性排斥反应。尽管临床器官移植应用的免疫抑制剂已经取得了令人注目的进展,但仍不能逆转慢性排斥反应,而这恰恰是移植器官长期存活的关键。因此,目前移植领域相关研究的一个重要目标就是阻断慢性排斥,同时避免全身免疫抑制的副作用。本实验室建立了大鼠腹腔异位心脏移植模型来研究慢性排斥反应阻断机制,发现阻断慢性排斥是T细胞浸润受到显著抑制,而T细胞浸润是细胞骨架肌动蛋白推动T细胞向移植物内迁移的过程[1-9]。我们最近的研究显示阻断慢性排斥反应需要在移植术后早期(1-7天)实施阻断,其导致了细胞骨架肌动蛋白结构发生了显著变化,而参与构建肌动蛋白和抗原递呈细胞的囊泡运输的Rho-GTP酶通路的分子下调。这些发现说明阻断慢性排斥反应需要通过干扰Rho-GTP酶信号通路来破坏T细胞的细胞骨架肌动蛋白的完整性和抗原递呈通路来实现,而这一研究将开创以Rho-GTP酶信号通路为靶向的免疫抑制治疗的新方向。近期的研究显示哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin,mTOR)激酶复合体1和2(雷帕霉素敏感的复合体1和不敏感度复合体2)都通过调节细胞骨架肌动蛋白和RhoA信号通路改变了细胞的迁移、囊泡运输和膜运输。本实验中,我们希望通过以大鼠心脏移植为模型,以雷帕霉素敏感的mTOR复合体1和不敏感度的mTOR复合体2及下游的靶分子RAC1信号通路的分子成份为研究对象,研究移植术后早期阻断慢性排斥反应的机制,并为免疫抑制的临床研究建立mTOR通路的模型。[方法]1.建立移植模型：成年雄性纯系Wistar Furth(WF,RT1.Au)大鼠为供体,ACI(RT1.Aa)大鼠为受体,行腹腔内异位心脏移植,并分为3个实验组：(1)移植后无处理对照组,(2)移植并使用低于治疗剂量CsA组(急性排斥反应),(3)移植后给予低于治疗剂量CsA+同种嵌合的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)1类分子组(本组无急慢性排斥反应)。而同种嵌合体多肽[alhl/u]-RT1.Aa(GenWay,San Diego CA;lmg/Kg)是在移植时经门静脉注入到受体ACI大鼠的体内[1-8]。每个实验组包含5只大鼠。2.T细胞分离：移植术后1、3、7天T细胞自ACI受体大鼠脾脏分离,并使用抗T细胞磁珠纯化。3. Western blot:用来评估比较慢性排斥反应与抑制慢性排斥反应状态下的目标蛋白表达水平的差异。T细胞于冰上加入细胞裂解液(0.15M NaCl,1%脱氧胆酸Na盐,1%Triton X-100,1%SDS0.01M TrisHCl,pH7.2)并加入蛋白酶抑制剂得到蛋白,Western Blot后,使用mTORCl信号通路抗体：抗mTOR(289KD),-Raptor(149KD),-GBL(36KD),-PRAS40(40KD),-DEPTOR(48KD); mTORC2信号通路抗体：抗Rictor(200KD),-mSINl(59KD)及抗RAC1抗体。蛋白条带使用Lumi-light Western Blot底物显影,条带密度使用Quantity One4.6.1(Biorad)系统分析。4.免疫染色与双重免疫染色：因mTORCl与C2两条通路均通过对细胞核、内质网、高尔基体的功能的影响而影响蛋白合成,从而影响T细胞细胞的功能。故使用免疫染色及双重免疫染色的方法研究两复合物各成分及下游信号分子在这三种细胞器的分布及表达水平,及在慢性排斥组和抑制慢性排斥组的变化。5.将ACI受体大鼠分为三组：阳性对照(接受7剂环孢素,10mg/kg/d),阴性对照(无处理),试验组(7剂环孢素,10mg/kg/d+Y-27632),术后100天取移植心脏标本。组织病理和免疫组化：移植物心脏取出后,放入福尔马林中,制成5μm石蜡组织切片,分别予以HE染色(了解大体形态)、Trichrome染色(胶原)、Verhoeff-van Gieson(VVG)染色(血管新生内膜)。6..统计分析：Western Blot结果使用Sigma plot分析,胶原含量与血管新生内膜使用均使用Image-Pro plus分析,胶原含量用胶原面积/(胶原面积+心肌面积)×100%,新生血管内膜表示为Neointimal Index(NI)=新生内膜面积/(血管腔+新生内膜面积)×100%。所有结果均以均数±标准差的形式表述,并使用T检验,P<0.05有意义。[结果]1.心脏异位移植大鼠模型成功建立,术后可长期存活,急慢性排斥受到抑制,为后续实验的顺利进行奠定了基础。2.Western Blot结果显示使用小剂量CsA+同种嵌合多肽的受体大鼠的移植心脏内,mTORCl和C2的部分成分及RAC1表达均下降,造成mTOR信号通路受到抑制,影响了细胞骨架肌动蛋白的合成,对T细胞的繁殖、运动产生影响,其对靶器官浸润减少。3.免疫染色显示：正常情况下mTOR/Racl位于细胞核周内质网及高尔基体中,并均匀分布于胞浆中,在CsA+peptide免疫抑制状态下向细胞膜聚集并呈片状分布于细胞膜附近。4.组织病理及免疫组化结果显示使用小剂量CsA+Y-27632的受体大鼠的移植心脏内,胶原含量较少,而且新生血管内膜NI也少于对照组。心肌纤维纤维化程度低,血管闭塞少是心脏慢性排斥反应受到抑制的表现。5.术前口服给予一剂Y-27632(2mg/kg),结合小剂量CsA也成功阻断了慢性排斥反应。术后病理HE染色显示术后100天,实验组对比两对照组,移植心脏心肌组织内淋巴细胞浸润明显少于对照组,纤维化程度也较低,基本保持了心肌正常结构。[结论]1.大鼠腹腔异位心脏移植模型成功建立,这是下一步研究急慢性排斥反应的分子通路机制的关键。2.试验组不仅RhoA表达下调,mTORCl,C2信号通路部分成分及下游RAC1表达均下调,在细胞内的分布改变,会影响T细胞的细胞骨架肌动蛋白合成,T细胞骨架结构发生变化,其增殖、运动、伪足形成下降,对移植心脏浸润能力下降,最终慢性排斥反应下降。阻断RhoA和Rac1通路是两条平行的抑制慢性排斥反应的手段。3.手术当天术前口服给予一剂Y-27632(2mg/kg),结合小剂量CsA也能减轻慢性排斥反应,这或许会是一种很有希望的抗慢性排斥反应的药物。