研究背景和目的：胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类健康。据统计,在全球全部恶性肿瘤中,胃癌发病率排在肺癌、乳腺癌、结直肠癌后居第四位,而死亡率在肺癌之后居第二位,2008年全球新诊断出的胃癌约990,000例,死亡人数高达约738,000。尽管在一些国家和地区的发病率和死亡率有所降低,但包括我国在内的东亚地区发病率仍较高。我国每年新确诊的患者约40万,胃癌仍然是我国三大常见恶性肿瘤之一。尽管目前胃癌的治疗手段得到了长足进步,除了手术治疗以外,各种辅助放、化疗及免疫治疗的发展在一定程度上提高了临床的治疗效果,然而,伴有淋巴结转移的晚期胃癌患者的预后仍然很差。因此,有部分学者认为,某些基因的存在可能有助于胃癌细胞向恶性潜能发生转化,但具体要鉴别究竟哪些基因可以用来预测胃癌的预后和复发仍然需要更加深入的研究。MicroRNA(miRNA)一种成熟的、小的、非编码的、单链、高度保守的内源性RNAs,通过与靶信使RNA (mRNA)3’端的非翻译区(3’UTR, untranslated regions),近乎完全互补结合在转录后水平使其降解,或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成,从而抑制靶蛋白编码基因的翻译及表达。miRNA在细胞核及细胞质中首先被转录为长的、初始片段pri-miRNAs,然后经过RNA内切酶ⅢDrosha剪切等一系列复杂过程,生成长度70 nt的miRNA前体(pre-miRNAs),最后pre-miRNAs被转运到细胞质,被Dicer酶切割成成熟的miRNA。到目前为止,人们已经发现了几百种miRNA。在人类的所有基因谱中,大约有30%的miRNAs参与调节蛋白质编码的各种基因。因此,miRNA具有多种生物学功能,调控多种生物学过程,参与细胞的发育、代谢、分化、增殖、自噬和凋亡等。miRNA与人类肿瘤的发生关系密切,miRNA对肿瘤的调控研究已发展成为生物医学最热门的研究领域之一,它们在肿瘤的发生发展、侵袭和转移过程中有异常的表达,并且可以发挥癌基因或抑癌基因的作用。越来越多的证据表明：miR-125家族在肿瘤组织中存在异常表达。miR-125家族由miR-125a, miR-125b-1及miR-125b-2组成,miR-125a位于染色体19q13上,有miR-125a-3p和]miR-125a-5p两种成熟体,分别来自miR-125a前体的3’端和5’端。miR-125家族在很多实体肿瘤中发挥抑癌基因功能。因靶基因的不同,miR-125a的表达水平不一致。在多种实体肿瘤中检测到：miR-125a的表达减少,包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及胶质母细胞瘤。还有研究发现miR-125a-5p的表达降低与胃癌发展潜能相关。此外,也有报道称被研究者普遍忽视的miR-125a-3p,在胃癌病变中与miR-125a-5p有着几乎相同的功能。除此之外,也有报道指出,在乳腺癌中发现miR-125a的编码区域发生突变可减少的miR-125a的表达,以上这些结果提示miR-125a的-5p和-3p可以作为抑癌基因,并下调miR-125a的表达,因此可能用作胃癌诊断和治疗的基因遗传标记。在乳腺癌中,miR-125a的编码区域发生突变可下调miR-125a的表达,那么miR-125a的编码区域在胃癌中是否也发生了突变?这种突变是否也能导致其表达下调?具体的分子机制如何?基于对以上问题的思考,在本研究中,我们首先检测了miR-125a-5p和-3p在人胃腺癌细胞系(MGC-803和BGC-823)以及胃癌组织与其邻近的正常胃组织表达水平。然后,我们对胃癌患者和健康志愿者(对照组)的miR-125a的编码区域进行基因分型,发现pri-miR-125a种系突变与胃癌发生和miR-125a的表达下调相关,这些结果表明miR-125a是胃癌的抑癌基因。方法：1.收集胃癌患者的临床组织标本。自2012年4月至2013年1月期间,我们共收集了山东省淄博市中心医院75对经病理证实的胃癌组织标本和距离癌灶5cm以上的癌旁组织标本(经HE染色证实)。所有患者均未接受过化疗、放疗或者其他治疗。手术获取的新鲜组织标本于20min内立即用液氮浸没降温,并置于液氮罐中保存。血液标本抽取287名健康汉族志愿者的静脉血。2.人胃癌细胞系体外培养实验。人胃腺癌细胞系MGC-803和BGC-823,均购自中国科学院上海生命科学研究院,采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。3.通过RT-qPCR法检测胃癌组织及癌旁组织miR-125a-5p和miR-125a-3p的表达水平。RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司,按照说明书进行操作。单链cDNA的合成采用MicroRNA Reverse Transcription试剂盒。按照TAKARA公司的荧光定量试剂盒的操作说明进行荧光定量PCR检测。4.DNA的收集和基因分型。胃癌组织和癌旁组织DNA的提取及血液样本的DNA提取采用TIANamp血液组织细胞基因组提取试剂盒。DNA样本使用标准的PCR方法进行扩增。PCR产物应用ABI公司的3730 x1测序平台正向测序。使用软件DNAMAN和Chromas Lite对测序结果进行分析。用于miR-125a的PCR测序引物分别为：上游5’-TGT GTC TCT TTC ACA GTG GAT C-3’和下游5’-CCA TCG TGT GGG TCT CAA G-3’。5. MiRNA的二级结构预测。在RNAfold网站操作获得对217个bp的pri-miR-125a二级结构,其中包括对突变位点的预测。6. MiR-125a的表达载体构建。为构建miR-125a的表达载体,将1016-nt片段对应pri-miR-125a,和它的侧面区域(之前确认两个区域等位基因)从cDNA克隆到pcDNA3.1载体上。序列产生的两个向量经过直接测序证实,唯一的区别是突变位点。引物分别是miR-125a-F/XhoI,5’-CCG CTC GAG GGT AGG AGG TTG TAT AGT TGA GGA GG-3’以及miR-125a-R/XbaI,5’-GCT CTA GAC CTC TGG GCC TCT CCT GC-3’。7.细胞增殖实验(CCK8法)。将MGC-803和BGC-823胃癌细胞接种至96孔板中,每孔加入5×103个细胞,以DMEM培养过夜。然后用不同类型的miR-125a载体进行细胞转染,以pcDNA3.1空载体作为对照组。转染后48小时,每孔加入10ul的CCK8,继续培养3h后,于450nnm处测定读取吸光度值。8.双荧光素酶报告基因分析。将ERBB2基因3’UTR片段(618bp)克隆插入到pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target载体上。将MGC-803和BGC-823胃癌细胞以2×1 O5个细胞／孔接种于48孔板,24h后将miR-125a表达载体及双荧光素酶载体共同转染入胃癌细胞,具体方法按照Invitrogen公司的产品说明进行。采用Dual-Luciferase Assay system进行检测。实验均设三复孔,并重复三次。9.统计学分析。应用SPSS16.0统计软件包进行数据分析。正态分布的计量资料用均数±标准差表示,两独立组间的资料采用t检验,偏态分布计量资料组问差异比较采用秩和检验,以P<0.05认定为差异有统计学意义。结果：1.胃癌组织中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表达均减少。为了探索miR-125a在胃癌发生中的作用,我们使用RT-qPCR的分析了75对胃癌组织和癌旁组织miR-125a的表达模式,将三例患者的癌组织RNA设为一组(75对共分成25组)。实验结果显示：胃癌组织中miR-125a-5p和miR-I25a-3p的表达水平分别减少了92%(23/25)和80%(20/25)。2.pri-miR-125a编码区域发生种系突变。核苷酸变异可以改变miRNA的表达,并证实与多种人类疾病相关。我们从胃癌组织中提取DNA进行pri-miR-125a编码区域测序,发现5位患者携带G等位基因,存在于miR-125a-5p中+43和pri-miR-125a中+29。此外,测序结果发现癌旁组织(正常胃组织)与胃癌组织的基因型相同。此外,我们对同一地区287名健康志愿者的G等位基因进行检测,未发现携带G等位基因的人,在1000genomes数据库中也没有找到这种等位基因。既然来自同一地区的健康人中没有携带G等位基因,因此在胃癌患者中G等位基因的存在不太可能是由于奠基者效应所致。上述这些结果表明,突变的pri-miR-125a可能与胃癌的发生有关。3.G变异可以增加1pri-miR-125a;隐定性并下调miR-125a的表达。为了研究这种突变的功能,我们首先比较了变异及未变异pri-miR-125a的二级结构。结果显示：G等位基因会导致在茎环的大小一个明显的变化(从8核苷酸循环到6核苷酸循环,从10核苷酸配对到12核苷酸配对),AG从-74.30kcal/mol.减少到-77.08kcal/mol。使用RT-qPCR和两种不同的表达载体携带miR-125a-5p等位基因,我们量化成熟miR-125-5p在两个胃癌细胞MGC-803和BGC-823中的表达水平。发现突变的存在使成熟miR-125-5p表达水平减少了约40%,这与RT-qPCR的分析结果相一致。4. miR-125a的表达下降,从而减弱了niR-125a对ERBB2的抑制效果及对胃癌细胞增殖的抑制作用。ERBB2基因,有报道认为它是miR-125-5p的靶基因,属于表皮生长因子受体(EGFR/ERBB)家族成员,在许多类型的癌细胞中呈过表达,并促进癌细胞增殖。我们使用了ERBB23’UTR研究突变对ERBB2基因表达的影响,发现转染miR-125a可减弱ERBB2的表达,这点在携带G基因的细胞中更加明显。为研究ERBB2的体内表达情况,我们采用RT-qPCR法检测胃癌和癌旁组织(正常胃组织)中ERBB2 mRNA的表达水平,发现癌组织中的ERBB2表达水平显著升高。5.基于ERBB2的功能,miR-125a表达下调可促进癌细胞增殖。我们采用细胞增殖实验,探讨不同miR-125a对胃癌细胞增殖活性的影响。首先获得不同的pri-miR-125a表达载体,分别携带A、G等位基因；然后将这两种不同的pri-miR-125a表达载体转染进入MGC.803和BGC-823胃癌细胞。正如预期所料,我们发现MGC-803胃癌细胞的增殖受到显著抑制(与对照组相比,P=0.0008 vs.P=0.0067),A到G的变异对细胞的影响约20%(P=0.023)。携带A等位基因的pri-miR-125a也能抑制BGC-823胃癌细胞的增殖(P=0.0075),但G变异的影响不大。结论：1.胃癌组织中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表达水平较癌旁正常组织明显降低。2.pri-miR-125a编码区域发生了种系突变。3.G变异可以增加pri-miR-125a稳定性并减少miR-125a的表达。4. miR-125a的表达减少,减弱了miR-125a对ERBB2的抑制效果及对胃癌细胞增殖的抑制作用。5. miR-125a是一种抑癌基因,其表达增加可抑制胃癌细胞增殖。研究意义：miR-125a在胃癌组织和正常组织中的表达存在显著差异,miR-125a的表达在胃癌的发生发展中可能发挥着重要作用,可能为胃癌患者的早期诊断和预后预测提供有效的依据,对miR-125a及其靶基因和调控通路的研究有重要的临床应用价值。