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目的:通过观察骨化三醇对缺氧诱导的肾小管上皮细胞(Humankedneyproxiamal tubular cells-2,HK-2)的影响,探讨骨化三醇对肾小管上皮细胞的保护作用及其通过肾小管上皮细胞途径改善肾纤维化的可能机制。 方法: 1人肾小管上皮细胞的培养:人肾小管上皮细胞株(HK-2),在37℃、5%CO2、饱和湿度下用含10%胎牛血清的DMEM/F121∶1培养基培养。将HK-2细胞分为5组:①空白对照组;②氯化钴刺激组;③氯化钴+10-10mol/L骨化三醇高剂量组;④氯化钴+10-11mol/L骨化三醇中剂量组;⑤氯化钴+10-12mol/L骨化三醇低剂量组。 2采用MTT法观察骨化三醇对氯化钴刺激人肾小管上皮细胞增殖能力的影响。 3采用Annexin V/PI双染法流式细胞术分析骨化三醇对各实验组人肾小管上皮细胞凋亡率的影响。 4采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)检测各组细胞培养上清液中VEGF、MCP-1、TGF-β的含量。 5采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)检测各组细胞VEGF、MCP-1、ICAM-1 mRNA的表达水平。 6采用免疫印迹(Western Blot)法检测各组ICAM-1蛋白的表达水平。 结果: 1骨化三醇对经氯化钴诱导的HK-2细胞增殖的影响 低氧可明显抑制HK-2细胞增殖,细胞培养液中骨化三醇的终浓度为10-11mol/L时,HK-2细胞增殖最明显,与氯化钴刺激组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 2骨化三醇对经氯化钴诱导的HK-2细胞凋亡的影响 氯化钴刺激组细胞凋亡率明显升高,与空白对照组相比,有统计学意义(P<0.05)。经不同剂量骨化三醇作用24h后,各组HK-2细胞凋亡率显著下降,与氯化钴刺激组比较,差异有统计学意义(P<0.05),骨化三醇低剂量组与高中剂量组有统计学差异(P<0.05)。 3骨化三醇对经氯化钴诱导的HK-2细胞VEGF、MCP-1、ICAM-1 mRNA表达的影响 氯化钴刺激组MCP-1、ICAM-1 mRNA表达较空白对照组显著升高(P<0.05),而VEGF mRNA表达较空白对照组相比升高不明显(P>0.05)。经骨化三醇作用24h之后,与氯化钴刺激组相比,HK-2细胞MCP-1、ICAM-1mRNA的表达明显抑制(P<0.05),而VEGFmRNA的表达显著升高(P<0.05)。空白对照组中VEGF、MCP-1、ICAM-1mRNA均有基础量表达。 4骨化三醇对经氯化钴诱导的HK-2细胞上清液中VEGF、TGF-β、MCP-1含量影响 氯化钴刺激组MCP-1、TGF-β的含量较空白对照组升高(P<0.05),而VEGF与空白对照组升高不明显(P>0.05)。经骨化三醇作用24h后,HK-2细胞MCP-1、TGF-β的表达水平降低,与氯化钴刺激组相比(P<0.05)。HK-2细胞VEGF的含量升高,与氯化钴刺激组相比(P<0.05)。空白对照组中VEGF、MCP-1、TGF-β均有基础量水平表达。 5骨化三醇影响氯化钴诱导的HK-2细胞ICAM-1的蛋白表达氯化钴刺激组ICAM-1蛋白与空白组相比明显升高(P<0.05),经骨化三醇作用24h后与氯化钴刺激组相比ICAM-1蛋白明显下降(P<0.05),以10-11mol/L组最为明显。 结论: 1骨化三醇具有抑制氯化钴诱导的HK-2细胞增殖活力下降和凋亡的作用。显示了骨化三醇对HK-2细胞的缺氧损伤保护作用。 2骨化三醇可减少氯化钴诱导的HK-2细胞趋化因子(MCP-1)、黏附因子(ICAM-1)和转化生长因子(TGF-β)表达,促进血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达。结果显示骨化三醇通过对缺氧状态下肾小管上皮细胞产生的炎性因子和强促纤维化因子的抑制作用及其上调缺氧保护因子VEGF表达的作用,能够降低肾小管细胞微环境炎性反应,从而发挥抗肾间质纤维化作用。 本结果揭示了骨化三醇通过对肾小管上皮细胞的缺氧损伤保护和抑制炎性反应作用发挥抑制肾间质纤维化的部分机制。