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第一部分:右美托咪定预处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的炎症反应 目的:观察右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤炎症反应的影响。 方法:体外培养大鼠心肌细胞(H9C2大鼠心肌细胞系和原代乳鼠心肌细胞)。实验随机分为5组,正常对照组(C组);缺氧复氧损伤组(H/R组);Dex预处理组(0.1μM、1μM、10μM)(D+H/R组)。应用甲基噻唑蓝比色法(MTT)检测心肌细胞的存活率,2、4-二硝基苯肼显色法检测培养基上清的乳酸脱氢酶(LDH)活性,倒置显微镜观察心肌细胞形态学变化,qRT-PCR技术检测TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达水平。 结果:与C组比较,H/R组心肌细胞的存活率显著降低(p<0.01),LDH活性显著升高(p<0.01);与 H/R组比较,Dex(0.1μM,1μM,10μM)预处理可提高心肌细胞的存活率,降低LDH活性,且1μM的Dex预处理可显著提高缺氧复氧损伤细胞的存活率(p<0.05),显著降低LDH活性(p<0.01)。与C组比较,H/R组 TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达水平显著升高(p<0.01);与H/R组比较,Dex预处理降低了炎症因子的水平(p<0.05)。倒置显微镜观察到:H/R组细胞坏死漂浮、细胞膜表面不光滑折光率低,Dex预处理可以减少细胞的坏死漂浮、改善细胞表面的不光滑和折光率的低下。在H9C2细胞系和原代乳鼠心肌细胞观察到相同的现象。 结论:右美托咪定预处理通过减少炎症介质的释放减轻H/R损伤的炎症反应,从而减轻H/R损伤,1μM的右美托咪定为预处理的最佳浓度。 第二部分:右美托咪定预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤TLR4/NF-кB信号通路的影响 目的:观察Dex预处理与对大鼠心肌细胞H/R损伤TLR4/NF-кB炎症通路的影响。 方法:体外培养大鼠心肌细胞(H9C2大鼠心肌细胞系和原代乳鼠心肌细胞)。利用对TLR4基因的沉默和过表达来探索Dex对大鼠心肌细胞H/R损伤TLR4/NF-κB信号通路的影响。细胞被分别随机分为4组。基因沉默部分分组:正常对照组(C组);缺氧复氧损伤组(H/R组);Dex预处理组(D+H/R组);TLR4基因沉默组(TLR4siRNA+H/R组)。基因过表达部分分组:缺氧复氧损伤组(H/R组);Dex预处理组(D+H/R组);TLR4过表达组(TLR4DNA+D+H/R组);空载体组(CON DNA+D+H/R组)。应用甲基噻唑蓝比色法(MTT)检测心肌细胞的存活率,2、4-二硝基苯肼显色法检测培养基上清的乳酸脱氢酶(LDH)活性,qRT-PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达水平,western blot检测TLR4和核内 NF-κB蛋白的表达。 结果:与H/R组比较,D+H/R组和TLR4siRNA+H/R组心肌细胞的存活率显著提高(p<0.05),LDH的活性显著降低(p<0.05);与 H/R组比较,D+H/R组和TLR4siRNA+H/R组TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达水平显著降低(p<0.05),TLR4和核内NF-κB表达显著降低(p<0.05);然而TLR4过表达逆转了Dex对心肌细胞生存率、LDH、炎症因子、以及 TLR4蛋白和核内 NF-κB蛋白的影响,差异具有统计学意义(p<0.05),而空载体组与D组的差异却无统计学意义。在H9C2细胞系和乳鼠原代心肌细胞观察到相同的现象。 结论:右美托咪定预处理通过下调 TLR4/NF-кB炎症通路,减少 TNF-α、IL-6、IL-1β炎症介质的释放,从而减轻大鼠心肌细胞H/R损伤。