手性化合物广泛应用于药物中间体和精细化学品的合成,C=C双键不对称还原是获取手性化合物最直接且通用的方法之一。鉴于生物催化具有温和的反应条件和良好的对映体选择性等优点,利用生物催化合成人们所需的化学品越来越受到重视。含黄素单核苷酸（FMN）的老黄酶可通过反式加氢反应,立体定向地催化C=C双键的不对称还原,获得手性化合物。然而老黄酶属于NAD（P）H依赖型氧化还原酶,在反应的过程中需要不断地消耗昂贵的辅因子。因此,构建自给自足的辅因子循环体系是实现老黄酶催化生产手性化合物的关键。基于此,本论文构建了老黄酶和葡萄糖脱氢酶的双酶共表达和融合表达体系,以廉价的葡萄糖作为氢供体,用于原位再生辅因子。为了提高所得酶催化体系的稳定性和重复使用性,并简化酶的纯化步骤,设计构建了一步纯化固定化系统来制备固定化生物催化剂,具体研究内容如下:（1）从基因库中调取来源于Bacillus subtilis老黄酶YqjM的基因序列,构建诱导型重组质粒pET28b His-YqjM,在E.coli BL21（DE3）中实现His-YqjM的可溶性表达。通过优化诱导表达条件,获得了高催化活性的His-YqjM,其生物表达量（湿菌体）和比酶活分别为7.32±0.91 g/L和681.95±4.17 U/g。通过研究其酶学性质发现,在pH为8.0、温度为30 ℃时酶的催化活力达到最大,Cu2+、Mg2+、Ca2+和Co2+对酶的活性具有较强的促进作用,而大多数有机溶剂（除正己烷和异辛烷外）均会严重抑制His-YqjM的活力。该酶催化2-甲基环戊烯酮的不对称还原反应时,对底物的Km值为0.58 mM。（2）以核糖体结合位点（RBS）作为连接器,构建了YqjM与来源于Bacillus megaterium IAM1030葡萄糖脱氢酶（GDH）的共表达双酶偶联体系。上游定位YqjM、下游定位GDH的共表达全细胞生物催化剂在2-甲基环戊烯酮的不对称还原中表现出良好的催化性能,当细胞浓度为125 g/L、NADP+浓度为0.05 mM、葡萄糖浓度为50 g/L和底物浓度为5 g/L时,于pH 8.0,30 ℃下反应4 h,（S）-2-甲基环戊酮的产率高达92%,ee值＞99%。（3）以柔性连接肽[GGGGS]3作为连接器,构建了YqjM与GDH融合表达双酶偶联体系,促进NADPH原位再生,实现共轭烯酮的高效不对称还原。利用His-tag与Ni2+-氮基三乙酸功能化的磁性介孔氧化硅（Ni-NTA-MMSN）表面Ni2+的特异性亲和作用,制备了固定化酶YqjM-Linker-GDH@Ni-NTA-MMSN。当NADP+浓度为0.05mM、底物浓度为10 g/L时,于pH 8.0,30 ℃下反应4 h,YqjM-Linker-GDH@Ni-NTA-MMSN催化生成（S）-2-甲基环戊酮的效果最佳（95%产率,＞99%ee）。相比于共表达全细胞催化剂,YqjM-Linker-GDH@Ni-NTA-MMSN催化效率进一步提高,具有更高的底物浓度耐受性、良好的稳定性以及重复使用稳定性。同时,YqjM和GDH双酶偶联体系在共轭烯酮不对称生物还原中显示出宽广的底物普适性。