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目的:多功能蛋白Tudor-SN是RNA结合蛋白,可参与细胞应激,发挥对mRNA的保护作用,并且可以通过形成RISC复合物参与RNA干扰等过程。可见Tudor-SN与RNA之间存在密切的联系。课题组已经利用Tudor-SN进行了Pulldown-on-chip mRNAs实验。本课题旨在进一步对Tudor-SN所结合的RNA进行功能分析以及调控机制的探讨。方法:本课题分为三大部分第一部分:对Tudor-SN Pulldown-on-chip mRNAs的结果进行生物信息学分析,并对结合结果进行验证。利用DAVID在线分析网络平台,对钓取的RNA结果进行GO分析和KEGG信号通路分析。在HeLa细胞中,采用RIP技术验证Tudor-SN与RNA的结果情况。第二部分:对Flag-Tudor-SN钓取蛋白的质谱结果进行生物信息学分析并进行结合验证。利用DAVID在线分析网络平台,对钓取的蛋白进行GO分析和KEGG信号通路分析。在HeLa细胞中,采用co-IP和GST pull down技术验证Tudor-SN与蛋白的结果情况。第三部分:研究Tudor-SN对其结合RNA和蛋白的调控作用。（1）Tudor-SN对其结合RNA核质分布的影响。在正常状态下,在HeLa WT和HeLa Tudor-SN-/-（以下简称为HeLa KO）细胞中分离胞核胞质RNA,RT-PCR检测RNA在细胞中的分布变化。（2）研究Tudor-SN对其结合RNA稳定性的影响。应用RNA合成抑制剂放线菌素D分别处理HeLa WT和HeLa KO细胞,RT-PCR检测该RNA在3小时,6小时,9小时,12小时等不同时间点的降解变化。（3）在应激状态下,Tudor-SN结合的三种应激颗粒蛋白较正常状态下核质分布的改变。在IPZ（转运受体importin-β小分子抑制剂）的作用下,三种应激颗粒蛋白核质分布的改变。在HeLa WT细胞中采用RNA干扰技术,敲低IPO5（入核转运受体）观察应激颗粒蛋白核质分布的改变。结果:1.生物信息学分析结果显示,Tudor-SN结合的mRNA主要参与的生物学过程包括翻译过程、RNA加工相关、细胞粘附、蛋白折叠、Wnt信号通路、细胞分类周期泛素化蛋白连接酶活性、T细胞受体信号通路、mRNA稳定性调控、抗原加工、NIK/NF-kappaB、DNA损伤应答、蛋白酶体泛素依赖的蛋白代谢调控、脂肪酸合成、ATP合成的分类。KEGG通路分析显示Tudor-SN结合的mRNA主要参与核糖体、代谢通路、氧化磷酸化、蛋白酶体、RNA转运、萜类化合物生物合、溶酶体等,并且参与到帕金森氏综合症、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病等相关疾病的信号通路中。对于Tudor-SN钓取的结果,在HeLa细胞中通过RIP实验进行了部分验证。2.生物信息学分析结果显示,Tudor-SN结合的蛋白主要参与的生物学过程包括poly（A）RNA结合,ATP结合,RNA解旋酶活性,ATP依赖性RNA解旋酶活性,双链RNA结合,蛋白质结合,解旋酶活性,泛素蛋白连接酶结合,钙粘蛋白结合参与细胞间粘附等。在内源和外源的IP结合实验和GST-puldown实验中,验证了核转运受体和与mRNA稳定性相关蛋白与Tudor-SN的结合。3.正常状态下,Tudor-SN对所结合的mRNA的核质分布的影响并不明显。在HeLa WT和HeLa KO中,加入RNA合成抑制剂放线菌素D。结果显示在HeLa WT细胞中,与Tudor-SN结合的mRNA的降解速率在加药后3小时,6小时,9小时,12小时的测量点均低于其在HeLa KO细胞中百分比值。4.应激状态下,三种应激颗粒蛋白hnRNP A1、HuR、TIA1细胞核强信号的细胞比例均比正常状态下降,细胞质强信号的细胞比例则升高。在应激状态下,hnRNP A1蛋白在IPZ（转运受体importin-β的小分子抑制剂）的作用下,细胞核强信号下降,细胞质强信号升高。将IPO5（入核转运受体）蛋白在HeLa细胞中进行敲除后,hnRNP A1蛋白的核质分布变化与加入IPZ相似。结论:1.将Tudor-SN结合RNA的数据,利用DAVID在线分析网络平台,得出GO分析结果:9类分子功能,28类生物学过程和25类细胞组分。KEGG信号通路分析,得出RNA主要参与了12类不同的信号通路。对于Tudor-SN钓取的结果,通过RIP实验进行了部分验证。2.将Tudor SN结合蛋白的数据,利用DAVID在线分析网络平台,得到GO分析结果:9类分子功能,72类生物学过程和14类细胞组分。KEGG信号通路分析,得出集合蛋白主要参与了2类不同的信号通路。在内源和外源的IP结合实验和GST-puldown实验中,验证了核转运受体和与mRNA稳定性相关蛋白与Tudor-SN的结合。3.在正常状态下,Tudor-SN对所结合的mRNA的核质分布的影响并不明显,可以维持所结合的mRNA的稳定性。4.在应激状态下,Tudor-SN与应激颗粒蛋白形成复合物,可能以应激颗粒的形式参与importin-β受体介导的对所结合mRNA的核质转运和应激保护。