论文部分内容阅读
骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在特定环境诱导条件下，MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞类型，在损伤组织的修复和再生中起着重要作用。MSCs从骨髓中动员、进入外周血循环向损伤组织位点定向迁移是其行使损伤组织修复功能的关键环节之一。研究发现，多种力学、化学因素在MSCs向损伤组织位点迁移过程中起着重要调节作用。力生长因子（Mechano-growth factor，MGF）是胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowth factor-1, IGF-1）基因选择性剪接产生的一种变异体，在多种组织/细胞中表达，具有力敏感性。研究证实，MGF能够激活卫星细胞、促进成肌细胞增殖，在治疗肌肉缺损、预防心肌损伤和修复受损神经等方面起着重要作用。目前，人们对于MGF如何影响MSCs的相关生物学行为还缺乏全面认识，其中涉及的分子机理更不清楚。因此，本文采用一种合成的大鼠MGF羧基端25个氨基酸组成的E肽（MGF-C25E），考察了MGF-C25E对大鼠MSCs（rat MSCs，rMSCs）增殖和迁移行为的影响特征及相关机理。该研究工作的主要内容和结果如下：1）rMSCs的分离、培养、鉴定结合密度梯度离心法和差时贴壁法从大鼠骨髓中分离rMSCs，用含10%胎牛血清的DMEM进行培养、传代，显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检查细胞表面相关抗原的表达和细胞周期分布。结果显示，分离的细胞接种后12-24h即可贴壁，形成漩涡状集落，细胞多呈梭型，铺展形态良好，7-10天生长近融合。流失细胞分析结果显示，CD34呈阴性表达，CD90和CD44呈阳性表达。细胞周期分布中，绝大多数细胞（94.23±0.84%）处于G0/G1期，符合干细胞周期分布的特征。2）MGF-C25E对rMSCs增殖行为的影响通过MTT法和细胞计数法分别考察了MGF-C25E对rMSCs增殖行为的影响。结果显示，10-70ng/mL的MGF-C25E处理rMSCs24-96h，与相应对照组比较，都未发现rMSCs增殖行为有明显变化。结果提示，在研究的浓度和作用时间条件下，MGF-C25E对rMSCs的增殖没有明显影响。3）MGF-C25E对rMSCs迁移行为的影响采用Transwell法考察了MGF-C25E对rMSCs迁移的影响。结果显示，10-100ng/mL的MGF-C25E都能促进rMSCs的迁移能力，在50ng/mL浓度刺激下达到峰值，随后迁移能力出现回落，但仍然显著高于对照组。结果证实，MGF-C25E能明显促进rMSCs的迁移。3）MGF-C25E促进rMSCs迁移行为的分子机理RT-PCR实验发现，MGF-C25E作用后rMSCs SDF-1基因及其受体CXCR4基因的表达上调。Western blot实验进一步发现，CXCR4蛋白水平的表达上调（p<0.05）。CXCR4抑制剂AMD3100抑制了MGF-C25E诱导的CXCR4表达上调，也抑制了MGF-C25E促进的rMSCs迁移。MGF-C25E处理rMSCs后ERK1/2磷酸化水平显著上调（p<0.05），ERK1/2抑制剂PD98059抑制了MGF-C25E对ERK1/2的激活，同时废除了MGF-C25E诱导的rMSCs迁移。此外，AMD3100也抑制了MGF-C25E诱导的ERK1/2磷酸化上调，消除了MGF-C25E促进的rMSCs迁移。结果提示，MGF-C25E可能通过SDF-1/CXCR4-ERK1/2信号通路促进rMSCs的迁移。4）MGF-C25E促进rMSCs迁移行为的细胞力学机理进一步采用原子力显微镜和免疫荧光染色方法分析了MGF-C25E作用下细胞力学特性和骨架的变化。结果发现，MGF-C25E处理rMSCs后，细胞的杨氏模量增加，细胞骨架F-actin聚合。AMD3100或PD98059预处理可消除MGF-C25E对rMSCs杨氏模量和F-actin的影响。上述结果表明，MGF-C25E可能通过SDF-1/CXCR4-ERK1/2信号通路促进F-actin的聚合，增加细胞硬度并最终促进rMSCs的迁移行为。