重症肌无力（MG）是一种对神经肌接头处烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinicacetylcholine receptor，nAChR）产生免疫反应的自身免疫性疾病。抗nAChR抗体激活的补体攻击反应可以导致nAChR甚至突触后膜的破坏，从而引起神经肌肉传导功能障碍。烟碱型乙酰胆碱受体为配体门控离子通道超家族成员之一，在神经肌肉接头中的突触后膜上介导化学信号向电信号的快速转化。这一家族蛋白包括甘氨酸受体、γ-氨基丁酸受体、谷氨酸受体及5-羟色胺受体。电鳐电器官及骨骼肌中的nAChR为较大的（Mr约290kDa）四种同源亚基组成的五聚体，电鳐及胚胎肌肉中为α12β1δγ，成人肌肉中为α12β1δε。亚基按α1-γ-α1-δ-β1的顺序形成一个圆柱形离子通道复合体。每个亚基都是一条多肽链，从N端到C端依次为：1个较大的N-末端胞外域（extracellular domain， ECD），3个跨膜域，1条较大的胞内环，第4个跨膜域和1个C-端尾位于胞外。nAChR N-末端胞外域对受体激动剂及竞争性拮抗剂都具有较高的亲和力。神经递质ACh主要作用在α1γ亚基和α1δ亚基交界处的两个不对等位点，而α-银环蛇毒素（α-Bungarotoxin，α-BTx）与nAChR的结合位点则主要是α1亚基N-末端胞外域。并且，α1亚单位胞外域还包括了主要免疫原区（main immunogenicregion， MIR），是刺激重症肌无力患者形成nAChR抗体的主要位点。外源注射nAChR能使动物产生nAChR抗体，并表现出重症肌无力症状，即免疫重症肌无力主动免疫动物模型。将来还有可能将nAChR用于结合重症肌无力患者血清内的致病抗体，从而达到去除致病抗体，缓解临床症状。有研究称，利用放射免疫法（RIA）检测MG患者血清抗-AChR抗体含量，以此作为诊断标准，其诊断敏感性为88%，且不同MG分型的阳性率也有所区别：早发眼肌型MG为71%，晚发眼肌型为88%，早发全身型为89%，晚发全身型为98%。而抗-AChR抗体阳性诊断MG的特异性高达99.9%。但是，目前国内没有将检测抗-AChR抗体作为常规诊断方法，通过我们的研究，我们成功建立了稳定的抗-AChR抗体放射免疫检测法，并希望该方法能与临床诊断相结合，提高MG诊断效率。实验性自身免疫性重症肌无力（Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）是发生在大鼠身上的，T细胞依赖的抗体介导的自身免疫性疾病，且整个免疫过程是单纯针对nAChR的免疫反应。作为研究重症肌无力的重要研究手段，EAMG模型的构建依然是我们研究该领域的重要基础。目前构建EAMG模型的原材料主要有两种：一种是电鳐电器官，一种是哺乳动物的去神经支配肌肉。目前在国内，电鳐价格昂贵且难以获取，而大鼠去神经支配术复杂且获取量少，所以我们考虑用重组表达nAChR的方法获得稳定且具有生物学活性的蛋白。本实验共尝试了两种方法表达nAChR：①C HO细胞表达人乙酰胆碱受体α亚单位胞外域。以nAChR α1基因全长为模板，PCR法扩增nAChR α1亚基ECD1-216，酶切后装入pcDNA3.1表达载体中，脂质体转染入CHO细胞，分别在转染后6~72h的7个时间点进行荧光实时定量PCR鉴定ECD基因的表达水平，利用125I标记的银环蛇毒素测定细胞培养上清中ECD蛋白的表达。②大肠杆菌表达含三个突变碱基的大鼠乙酰胆碱受体α亚单位胞外域。将大鼠AChRα1亚基胞外域蛋白中三个氨基酸进行突变，分别为Val8Glu，Trp149Arg，Val155Ala，送公司合成上述基因。将合成基因插入pET-22b载体中，然后在Bl-21菌株中大量表达。鉴定表达正确的蛋白用溶液稀释法进行蛋白复性。综上所述，本实验尝试可通过真核或原核细胞表达重组nAChR的方法来替代来源短缺的天然nAChR，同时建立快捷、简便的抗nAChR抗体检测方法，提高临床MG的诊断效率。