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神经肽W(neuropeptide W, NPW)是2002年Shimomura从猪下丘脑中分离的一种神经肽,由于其第一个和最后一个氨基酸为色氨酸(Trp,缩写为W),故命名为神经肽W。NPW有两种形式,NPW23和NPW30,分别含有23和30个氨基酸。NPW为G蛋白偶联受体G PR7 (NPBWR1)和GPR8 (NPBWR2)的内源性配体。GPR7和GPR8的结构相似,核苷酸和氨基酸同源性分别为70%和64%。GPR7在人和啮齿动物高度保守,但在啮齿动物中却未发现GPR8基因的存在。NPW及其受体广泛分布于中枢神经和外周组织器官,参与摄食、能量平衡、神经内分泌、生殖、炎性疼痛、自主功能以及情绪行为等多种生理功能的调节。目前,国内外研究人员对许多物种NPW的基因结构、分布定位及生理功能等做了大量研究,但至今尚未见任何关于猪NPW分布定位及生理功能的研究报道。因此,本文以猪为研究对象,采用同源克隆、RT-PCR、免疫组织化学等方法研究了猪神经肽W及其受体的分布定位和其1nRNAs在母猪发情周期中生殖轴上的表达变化。研究内容主要有：猪NPW及其受体的基因克隆和其mRNAs在组织器官的表达；NPW和GPR7在猪体内的分布定位；母猪发情周期(发情前期、发情期、发情后期和间情期)中NPW及其受体mRNAs在下丘脑-垂体-卵巢轴上的表达变化。通过以上研究旨在从分子和形态学水平系统探讨NPW及其受体在猪体内的分布定位和在母猪发情周期中的表达变化。一、猪NPW及其受体的基因克隆和组织表达本实验采用同源克隆技术克隆了猪NPW及其受体的基因序列并进行序列分析。然后,采用RT-PCR的方法研究NPW及其受体mRNAs在猪各组织器官中的表达情况。结果如下：1.克隆得到了猪NPW、GPR7和GPR8的基因片段,片段大小分别为312、542和420 bp,并将GPR7和GPR8的基因序列提交至GenBank数据库获得登录号分别为KF361314和KC441488。猪NPW及其受体的核苷酸及氨基酸序列与其他物种同源性较高。克隆得到的GPR7和GPR8具有典型的G蛋白偶联受体跨膜结构。NPW基因定位于猪3号染色体,而GPR7和GPR8基因定位于猪4号染色体。2.NPW及其受体mRNAs广泛存在于猪中枢神经系统和外周组织器官,且NPW及其受体mRNAs在外周的分布更为丰富。二、NPW和GPR7在猪体内的分布定位本试验采用免疫组织化学的方法研究了NPW和GPR7在猪体内的分布定位,结果如下：1.NPW免疫阳性(-ir)在猪中枢神经系统内的分布较为局限,NPW-ir神经元散在分布于下丘脑室旁核(PVN)和视上核(SON),而丰富的NPW-ir纤维存在于PVN、弓状核(ARC)、下丘脑腹内侧核(VMH)、下丘脑背内侧核(DMH)、SON和下丘脑外侧区(LHA)。外周组织器官的NPW-ir则广泛分布于呼吸系统、消化系统、循环系统、泌尿生殖系统、内分泌系统和淋巴器官中。2.GPR7-ir与NPW-ir在猪体内的分布相似。在中枢神经系统,仅在PVN发现了GPR7-ir神经元。在外周组织器官中,GPR7-ir也广泛分布于呼吸系统、消化系统、循环系统、泌尿生殖系统、内分泌系统和淋巴器官中。3.NPW和GPR7的分布在不同物种间既存在保守性,也存在种间的差异性。三、母猪发情周期中NPW及其受体mRNAs在生殖轴的表达变化本试验首次采用半定量RT-PCR方法对生殖周期中NPW及其受体mRNAs在母猪生殖轴上的表达模式进行了系统的研究,结论如下：1.发情周期中NPW及GPR8 mRNAs在母猪下丘脑的表达呈规律性波动且表达变化趋势非常相似,而GPR7 mRNA表达变化与NPW差异较大。NPW mRNA在发情前期和发情期表达含量较低,在发情后期和间情期表达量显著升高,在间情期表达丰度达到最高值。GPR7 mRNA在发情后期表达量最低,在间情期表达量最高,但相对于发情期的表达量变化差异不显著,且发情前期的表达量略低于发情期。GPR8mRNA在发情前期表达量最低,从发情期开始逐渐升高至间情期时表达丰度最高。2.发情周期中NPW及GPR8 mRNAs在母猪垂体的表达呈规律性波动且表达变化趋势非常相似,也与其在下丘脑中的表达趋势相似,而GPR7 mRNA表达变化与NPW有所差异。NPW和GPR8 mRNAs均在发情前期表达量最低,从发情期开始逐渐升高至间情期时表达丰度最高。发情前期表达丰度极显著低于发情期,发情后期及间情期极显著高于发情期。GPR7 mRNA的表达量在发情前期最低,并显著低于发情期。发情期至间情期GPR7 mRNA的表达无显著差异。3.发情周期中NPW及GPR8 mRNAs在母猪卵巢的表达呈规律性波动且表达变化趋势极其相似,但与其在下丘脑和垂体中的表达趋势不同,而GPR7 mRNA表达变化差异不显著。NPW及GPR8 mRNAs在发情期表达量最高,其他发情周期的表达量均极显著低于发情期,且在发情前期表达丰度最低。GPR7 mRNA表达量在卵巢中的变化差异不大,在发情前期的表达量略低于其他时期。以上试验从分子和形态学水平系统地探讨了NPW及其受体在猪体内的分布定位以及在母猪发情周期中的表达变化,为今后猪NPW生理功能的研究奠定了基础。