【摘 要】
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真核细胞中基因组的DNA损伤与凋亡有重要的内在联系。对于有未能修复DNA双链断裂、端粒功能障碍或处于异常多倍体状态的细胞,DNA损伤响应蛋白可以调节细胞凋亡,清除包含过量DNA残留损伤或严重错误修复的细胞,从而维持机体整体或组织细胞基因组的稳定性,避免细胞癌变。H1.2是连接组蛋白H1的一种亚型,是核小体间的结构性蛋白。H1.2在DNA损伤后由细胞核转位到线粒体,进而诱导细胞色素c的释放参与凋亡信
【基金项目】
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国家自然科学基金（32101165）；
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真核细胞中基因组的DNA损伤与凋亡有重要的内在联系。对于有未能修复DNA双链断裂、端粒功能障碍或处于异常多倍体状态的细胞,DNA损伤响应蛋白可以调节细胞凋亡,清除包含过量DNA残留损伤或严重错误修复的细胞,从而维持机体整体或组织细胞基因组的稳定性,避免细胞癌变。H1.2是连接组蛋白H1的一种亚型,是核小体间的结构性蛋白。H1.2在DNA损伤后由细胞核转位到线粒体,进而诱导细胞色素c的释放参与凋亡信号的传导。然而,组蛋白H1.2转位到线粒体诱导细胞凋亡的靶标蛋白与机制仍不清楚。目的:（1）研究DNA损伤后组蛋白H1.2诱导细胞色素c释放的线粒体靶标蛋白;（2）发现组蛋白H1.2传导凋亡信号的新机制。方法:（1）通过质谱鉴定辐照后可能与Mfn2相互作用的蛋白,采用免疫共沉淀（Co-IP）验证辐照前后Mfn2与组蛋白H1.2是否存在相互作用;（2）免疫荧光共定位（IF）检验辐照后Mfn2和组蛋白H1.2在细胞中的定位情况;通过NE-PER核和细胞质提取实验分别提取细胞质蛋白与细胞核蛋白,Co-IP实验确定辐照后Mfn2与H1.2相互作用的位置;（3）Co-IP实验检测辐照后不同时间点组蛋白H1.2与Mfn2相互作用的变化趋势;（4）分别构建带有Flag标签的H1.2和Mfn2质粒、带有GST标签的H1.2质粒以及带有Flag标签的Mfn2结构域缺失突变体,验证所构建质粒的表达情况,研究H1.2与Mfn2相互作用的结构域;（5）流式细胞仪检测Mfn2敲低细胞系与野生型细胞在电离辐射前后的周期分布情况,并对G2/M期的细胞进行统计分析;（6）流式细胞仪检测野生型与分别敲低了Mfn2和H1.2的细胞在电离辐射前后的凋亡情况,并进行统计分析。结果:（1）电离辐射诱导DNA损伤后,组蛋白H1.2与Mfn2存在相互作用,而与Mfn2的同源蛋白Mfn1无法结合,且未观察到Mfn1与Mfn2相互作用受到辐照损伤的影响;（2）免疫荧光结果显示,Mfn2在辐照前后均主要围绕细胞核定位于细胞质,组蛋白H1.2主要定位于核内,照射后可见部分核外定位;Co-IP实验发现电离辐射后Mfn2与组蛋白H1.2的相互作用主要发生在细胞质;（3）Co-IP实验结果表明组蛋白H1.2与Mfn2的相互作用在电离辐射后明显增强;（4）蛋白免疫印迹结果表明Mfn2突变体表达良好,且GSTH1.2全长可进行原核表达;（5）敲低Mfn2对DNA损伤后的G2/M周期阻滞没有明显影响;（6）流式结果分析显示电离辐射对分别敲低H1.2与Mfn2细胞凋亡的百分比只有微弱的影响。结论:本项研究发现电离辐射诱导DNA损伤后,组蛋白H1.2与Mfn2的相互作用主要发生在细胞质且其相互作用在电离辐射后明显增强;敲低Mfn2对DNA损伤后的G2/M周期阻滞没有明显影响;辐照后H1.2与Mfn2敲低对细胞的凋亡只有微弱的影响,差异无统计学意义。
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