基于斜置开顶式光片成像的高通量荧光微滴检测技术研究

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聚合酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)是一种对微量核酸分子进行检测的重要手段。第一代PCR是用琼脂糖凝胶电泳技术进行定性分析,第二代实时荧光PCR(qPCR)是一种相对定量分析,而第三代数字PCR(dPCR)可以实现绝对定量分析。PCR技术的发展在精准医疗、分子检测、基因工程、食品安全、环境检测等领域得到越来越广泛的应用。进一步提高第三代数字PCR技术的检测准确性、检测规模具有实际意义。目前基于微孔板(microcapillary array MiCA)和离心机生成的透明化微滴并使用传统光片系统进行荧光检测的技术路线优势突出。这种数字PCR技术称为透明化数字PCR技术(CLEAR-dPCR),不仅具有微滴生成过程、PCR扩增过程和荧光检测过程一体化的优势,并且微滴生成方式简单快速,检测过程无污染无损耗,检测精度高、动态范围大的优势,但检测规模有待进一步提高。斜置开顶式(open-top)光片系统由于其顶部开放式样品操作空间,使得大规模成像成为可能。研究了针对微滴尺寸进行成像的光片参数。针对特定的成像对象即多个PCR管,通过对斜置开顶式系统中光路和样品进行ZEMAX光学建模设计,分析了该系统在扫描过程中光学参数变化趋势。研究了光阑直径大小对像差的影响,通过控制物镜后光阑孔径大小使得光路像差控制在一定范围内。理论上验证了斜置开顶式光片系统实现微滴荧光检测的可行性。再通过实际光路的三维物理模型计算出样品腔及转接部件的尺寸,进一步完成设计加工,为完成实际光路搭建做准备。设计了自动化扫描以及图像采集的运动控制程序以完成多个样品一次性图像获取,使图像采集过程自动化;检测速度达13.3μL/s。运用基于MATLAB的图像处理程序或者三维图像处理软件对获取的图像进行计数统计分析。最终验证了斜置开顶式光片成像技术对一系列浓度梯度的微滴荧光信号可以实现高动态范围、三维原位读出,具有高通量检测的优势。为高通量、大规模的数字微滴PCR检测的应用做了可行性探索和研究。
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