论文部分内容阅读
目的:急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种常见的高度异质性的血液系统恶性肿瘤,其特征为髓系造血祖细胞克隆增殖异常、分化障碍、凋亡受阻。micro RNAs(mi RNAs)是一种小分子非编码RNA,在细胞增殖、转移、凋亡和分化等生物学进程中发挥着重要的调控作用。近年来研究报道了mi RNAs的异常与急性髓系白血病的发生、发展密切相关,并为mi RNAs应用于白血病的诊断和治疗提供新依据。本课题检测mi R-125a-3p在不同病期、不同分型急性髓系白血病患者外周血中的表达情况,并研究mi R-125a-3p诱导AML细胞凋亡和分化、抑制AML细胞迁移的作用,初步探索其作用机制。方法:(1)采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测143例AML患者外周血标本中mi R-125a-3p的表达水平,其中,初诊组64例,复发组15例,治疗组64例。另选择16例正常人作为对照。随机选择初诊组中7例患者进行mi R-125a-3p动态监测。(2)使用0.1μM维甲酸、10μM地西他滨、1μM三氧化二砷、10μM阿糖胞苷四种药物处理人急性髓系白血病细胞株THP-1、HL-60、NB4,共同孵育24小时,采用q RT-PCR方法检测mi R-125a-3p表达水平。(3)构建mi R-125a-3p慢病毒过表达载体、慢病毒空载体(Non-carrier,NC)分别转染THP-1细胞,转染后培养48-72小时,采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b,CD14和细胞凋亡率,分光光度法检测caspase-3、caspase-8、caspase-9酶活性,Transwell方法检测迁移能力,q RT-PCR检测细胞分化和凋亡相关基因的m RNA水平变化。结果:(1)与正常对照组比较,初诊组和复发组患者外周血中mi R-125a-3p的表达水平明显减低,且差异有显著性(P<0.05);而治疗组患者外周血中mi R-125a-3p的表达水平较初诊组显著升高(P<0.05),接近正常人水平。在各型AML患者中(除M3外),初诊组mi R-125a-3p水平较正常对照组均有不同程度的降低(P<0.05),M0型最低,M5型次之;治疗组mi R-125a-3p水平较初诊组显著上调(P<0.05),甚至高于正常对照组水平,以M2、M4型增高较为明显。7例患者mi R-125a-3p动态监测结果显示,在治疗过程中,mi R-125a-3p表达一直维持在较高的水平;1例患者缓解4~5个疗程后复发,其mi R-125a-3p表达再次降低。(2)三氧化二砷、地西他滨处理三种细胞株后mi R-125a-3p表达都上调,以三氧化二砷处理后增加较为明显。(3)流式细胞术检测发现,与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞表面CD11b,CD14表达和凋亡率均显著增加(p<0.05)。分光光度法检测结果显示,与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性显著增加,提示细胞凋亡显著增加(p<0.05)。Transwell方法检测发现,与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞迁移显著减慢(p<0.05)。进一步采用q RT-PCR检测细胞分化和凋亡相关基因,发现与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞分化相关的转录因子ATF-2表达明显增加(p<0.05);与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组促凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9表达均增加(p<0.05),抗凋亡基因Bcl-2、c-myc、NF-KB、Bcl-xl表达均减少(p<0.05)。结论:(1)mi R-125a-3p在初诊AML患者外周血中低表达,在诱导治疗过程中其表达升高,复发时再次降低,mi R-125a-3p有望成为AML诊断、疗效评价和复发监测的指标。(2)AML化疗药物三氧化二砷、地西他滨可上调mi R-125a-3p表达,尤以三氧化二砷为显著。(3)过表达mi R-125a-3p能促进THP-1细胞分化和凋亡,抑制细胞迁移,其诱导细胞分化的机制可能与上调细胞分化相关的转录因子ATF2相关,而诱导细胞凋亡则是通过激活线粒体途径完成,NF-KB通路、c-myc基因可能参与了mi R-125a-3p诱导的细胞凋亡。