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【研究背景及目的】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,肝癌患者的总体生存时间较短,目前手术切除是肝癌患者最佳治疗手段,但该方法仅适用于部分患者(约10%-20%),且术后复发率较高,因此迫切需要寻找新的肝癌治疗靶点与治疗手段。肝癌的发生发展与慢性炎症过程密切相关,常伴有―肝炎-肝硬化-肝癌‖的慢性恶性转化的过程。慢性炎症与肿瘤的关系已得到了广泛认同,然而其机制仍需深入研究。CD47(Cluster of Differentiation 47)是一种普遍表达在人类细胞表面的糖蛋白分子,属于免疫球蛋白超家族成员。早期发现CD47能与整合素αvβ3共沉淀而被称之为整合素相关蛋白。人类多种肿瘤中CD47分子的表达水平均呈现上调,在肿瘤发生发展中发挥重要作用。肿瘤细胞CD47通过抑制巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫,逃避机体―免疫监视‖,而这种作用是通过与巨噬细胞SIRPα(signal-regulatory protein alpha)相互作用实现的。在多种肿瘤的研究中,科学家们发现利用CD47单克隆抗体能有效抑制肿瘤的体内生长,而对正常细胞影响较小。以上结果表明CD47分子可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。目前普遍认为CD47单抗的治疗效果与阻断CD47介导的吞噬抑制作用有关。关于CD47在肝癌进展中的作用研究尚处于初步阶段。有文献报道CD47参与调节肝癌干细胞的存活与功能,但其所涉及的机制不为人知。细胞可以通过氧化还原酶类和其他抗氧化分子来维持细胞内氧化还原状态(Redox Status)的稳定。当细胞内产生过多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)超过细胞自身调节能力时,会使细胞产生氧化应激。因为有增强的抗氧化系统保护肿瘤干细胞免遭ROS介导的损伤,所以在肿瘤干细胞当中ROS水平往往较低,从而使其获得抵抗化疗和放疗的能力。在这些抗氧化系统中,还原型谷胱甘肽是其中一种重要的细胞代谢产物,它的合成需要xc-系统的参与。xc-系统是胱氨酸-谷氨酸交换转运蛋白,由一条轻链(SLC7A11,solute carrier family 7 member 11)和一条重链(SLC3A2,solute carrier family 3 member 2)组成。其中SLC3A2分子可以与整合素相互作用从而介导整合素相关信号通路的激活,引起正常细胞的增殖和肿瘤的发生。这让我们想到SLC3A2可能与CD47分子有某些联系。在本研究中,我们首先对肝癌标本上CD47分子的表达进行分析,然后对调控CD47分子表达的相关因素进行研究,之后利用多种方法探究CD47分子对肝癌细胞生物学效应的影响,发现CD47分子可以调控细胞氧化还原状态,并对其可能的分子机制进行探索,以期发现CD47分子对肿瘤细胞产生细胞生物学效应的原因。【实验方法】1.应用real-timepcr方法和冰冻切片细胞免疫荧光的方法检测肝癌组织标本中cd47分子表达的情况;并利用大鼠den诱导肝癌模型检测在―肝炎-肝硬化-肝癌‖病程进展中cd47分子表达水平的变化。2.利用流式细胞仪、real-timepcr和共聚焦显微镜检测nf-κb信号通路的活化对cd47分子表达水平的影响,并通过软件分析cd47启动子区预测相应转录因子结合位点,并通过染色质免疫共沉淀试验(chip)加以验证。3.建立cd47分子干扰和过表达肝癌细胞系,应用cck-8方法检测cd47分子干扰和过表达组与对照组细胞的增殖能力;应用westernblot方法检测cd47分子表达水平的高低对细胞egf信号通路的影响。4.应用裸鼠荷瘤模型检测cd47分子高低表达对肝癌细胞体内增殖的影响。5.通过transwell小室法检测cd47分子表达水平的高低对细胞体外迁移能力的影响。6.应用real-timepcr方法检测cd47分子高低表达对肝癌细胞糖代谢相关基因表达的影响,并用试剂盒检测葡萄糖消耗和乳酸生成的变化。7.用ros特异的荧光探针dcfh-da检测cd47分子高低表达对肝癌细胞氧化还原状态的影响。8.应用real-timepcr方法检测cd47分子高低表达对肝癌细胞内抗氧化相关基因表达的影响,并检测细胞内还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的含量。9.应用质谱分析方法检测与cd47相互作用的分子并通过免疫共沉淀方法进行验证。【实验结果】1.肝癌标本中cd47表达水平相比于癌旁和远端有明显的升高,且在den大鼠诱导肝癌模型中表达水平随着病程的进展不断升高。2.nf-κb信号通路的活化可以上调cd47分子的表达,p65蛋白通过与cd47启动子区结合调控cd47分子表达。3.cd47分子促进肝癌细胞的体内体外增殖能力,迁移能力并且cd47分子促进肝癌细胞糖代谢相关基因的表达,增加肝癌细胞葡萄糖消耗和乳酸的产生。4.cd47分子的表达可以降低细胞内ros水平,参与细胞氧化还原状态的调控。5.cd47分子促进肝癌细胞抗氧化基因的表达,并且升高肝癌细胞内还原型谷胱甘肽的含量,提高还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比值。6.质谱分析发现cd47分子可以和slc3a2分子相互作用,通过免疫共沉淀方法也得到了验证。【实验结论】本研究证实了肝癌标本中cd47分子表达水平较高,并在肝癌模型中证明cd47表达水平随着病程的进展不断升高。炎性因子TNFα等激活NF-κB信号通路可能是导致其升高的因素。CD47通过降低细胞内ROS水平来促进肝癌的恶性表型,并且其对氧化还原状态的调控可能是通过与SLC3A2分子相互作用来完成的。