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动脉粥样硬化(artherosclerosis,AS)目前被认为是一种炎症和免疫性疾病。树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前已知的机体内功能最强的专职抗原提呈细胞,能激发免疫应答和诱导免疫耐受。缝隙连接cx43是连接细胞间细胞质的一种蛋白,DC细胞表面的cx43与抗原传递有着密切的关系,炎症反应时,DC的connenxin43可发生上调。我们在成功建立体外扩增高纯度小鼠骨髓树突状细胞(BM-DC)方法的基础上,利用RNA干扰技术(RNAi)针对connexin43基因,筛选出最佳的siRNA序列,用于构建connexin43基因沉默的connexin43-SiRNA-BMDC,并从细胞表面分子表达、细胞免疫功能等方面对RNA干扰的DC的生物免疫学特性进行了研究,验证其诱导T细胞免疫耐受特性,其后进一步研究经RNAi沉默connexin43后的DC在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化中的作用。第一部分树突状细胞connexin43基因沉默及效果检测目的:合成针对小鼠树突状细胞((dendritic cell,DC)表面connexin43分子的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)序列,采用电穿孔方法筛选出DC中connexin43基因沉默的有效序列。方法:1、骨髓DC的体外培养与鉴定研究:分离C57BL/6小鼠骨髓前体细胞,在重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素4(rmIL-4)刺激下,培养扩增骨髓来源DC(BM-DC),并通过细菌脂多糖(LPS)刺激诱导DC成熟。2、树突状细胞connexin43基因沉默方法的选择及效果检测研究:根据siRNA设计原则预先设计3段connexin43-siRNA序列,化学合成相应的3种connexin43-siRNA(R1/siRNA、R2/siRNA、R3/siRNA),采用电穿孔方法转染体外培养的未成熟DC,并选择有效的剂量。实验分为六组:①Control-DC组;②电击无SiRNA的DC组;③nonsense/siRNA转染组:用nonsense/siRNA转染DC;④R1/siRNA转染组:用R1/siRNA转染DC;⑤R2/siRNA转染组:用R2/siRNA转染DC;⑥R3/siRNA转染组:用R3/siRNA转染DC。采用Realtime PCR和western blot方法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测比较各组DC的connexin43基因表达情况,筛选出cormexin43基因沉默效果最好的有效siRNA序列。3、使用台盼蓝染色法检测转染组和对照组间细胞活力。结果:1.在rmGM-CSF和rmIL-4诱导下,成功的从小鼠骨髓培养扩增出大量DC,每一只小鼠可获得BM-DC约1～2×10~7个,BM-DC中CD11c阳性率达90%以上,可满足实验需要。2.化学合成方法可以得到设计好的针对connexin43基因3个不同位点的connexin43的siRNA,可用于骨髓未成熟DC的转染实验。Realtime PCR显示,与另外两个位点相比,R2/siRNA可以明显抑制细胞connexin43基因表达(P<0.05);westem blot分析结果也显示R2/siRNA可以明显减弱connexin43蛋白表达水平。3.与对照组比较,电穿孔及有效序列R2/siRNA处理后的DC活力未降低。结论:1.小鼠骨髓前体细胞在rmGM-CsF和rmIL-4诱导下,可扩增到大量的DC。2.利用电穿孔法可有效的将SiRNA转染入DC,R2/siRNA转染DC可以在mRNA和蛋白质水平明显抑制细胞connexin43基因表达,是最佳的候选siRNA靶位点。3.电穿孔法可有效的转染DC,并且不影响DC细胞活力。第二部分connexin43基因沉默对树突状细胞的免疫生物学功能影响目的:在成功转染RNAiconnexin43的基础上,从DC细胞表面分子表达、细胞免疫功能等方面对RNAi-connexin43DC的生物免疫学特性进行了研究。方法:实验分成三组:①Control-DC组;②电击无siRNA-DC组;③connexin43基因沉默组(RNAi/connexin43-DC):经过connexin43siRNA处理的DC。分别用western blot、流式细胞技术和混合淋巴细胞反应(MLR)等从DC细胞connexin43蛋白水平、细胞表面分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达、细胞免疫功能等方面对RNAi的connexin43基因沉默的DC的生物免疫学特性进行了比较研究。结果:1.与对照组和电击无siRNA-DC组比较,RNAi/connexin43-DC组的DC细胞connexin43表达降低。2.RNAi/connexin43-DC组DC细胞表型检测MHCⅡ类分子低水平表达,共刺激分子低表达(CD40、CD80、CD86)。3.RNAi/connexin43DC刺激T细胞增殖能力较Control-DC和电击无siRNA-DC组减弱,其中当T/DC比例为20:1,50:1和100:1时,组间差异均有显著性(P<0.05);单纯电穿孔无siRNA的DC刺激T细胞增殖能力未见明显增高(P>0.05)。结论:1.RNAi/connexin43-DC细胞抑制DC细胞成熟,表达MHC-Ⅱ类分子、CD4D、CD80、CD86等表面分子相对较低,混合淋巴反应显示刺激T细胞增殖能力减弱。2.电穿孔方法不影响DC细胞生物学特性。第三部分输注connexin43基因沉默的树突状细胞对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响目的:探讨输注siRNA干扰后DC对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响。方法:12周龄ApoE-/-小鼠共30只。实验分成三组:①对照组(n=10):输注PBS;②DC干预组(n=10):输注未RNAi的DC;③RNAi/DC干预组(n=10):经过connexin43siRNA处理的DC。在ApoE基因缺陷小鼠模型中,每周皮下输注经connexin43-siRNA干扰后的DC一次。12周后,通过病理HE染色观察各组动物主动脉粥样硬化程度,免疫组化和western blot方法检测主动脉斑块中connexin43的蛋白表达。结果:在RNAi/DC干预组中,ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化程度明显低于对照组和未干扰DC组(P<0.05)。与DC干预组及对照组相比,RNAi/DC干预组动脉粥样硬化的动脉血管中connexin43的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:在ApoE-/-小鼠模型中,RNAi基因沉默connexin43的DC对动脉粥样硬化有保护作用,其机制可能是通过诱导T淋巴细胞无能有关。而动脉血管中的connexin43表达降低可能也参与抗动脉粥样硬化作用。