QT间期延长综合征(LQTS)是以心电图QT间期延长为主要特征的一种遗传性心律失常。其主要原因是心脏的延迟复极。患者易出现阵发性的尖端扭转型室性心动过速(TDP)、心室纤颤,甚至导致晕厥和猝死。而且,具有家族性遗传基因的年轻人常因此而出现心源性休克,其病死率较高。目前研究表明,LQTS根据病因及发病机制可分为LQT1-12及JLN1-2共14种。LQT4的发病机制与发生在染色体4q25-27上的ankyrin-B基因突变导致该基因编码的ankyrin-B蛋白(ANKB)出现功能异常直接相关。ANKB是心血管系统中离子通道和转运蛋白信号复合物的关键部位,结构上可以分为膜结合结构域、血影结合结构域、羧基端结构域和“死亡”结构域,而羧基端结构域和“死亡”结构域又合称为调节结构域。研究表明,1型Na+-Ca2+交换器(NCX1)、 Na+-K+-ATP酶α1/α2(Na+/K+ATP α1/α2)和三磷酸肌醇受体(IP3R)是ANKB的结合蛋白,ankyrin-B基因突变所致的功能障碍是导致室性心动过速,甚至猝死以及病窦综合征等一系列复杂的心电紊乱表型的主要原因。近来,大量的动物模型研究还发现,ANKB在维持正常心功能中发挥着极其重要的作用。迄今为止,已经发现的ankyrin-B基因碱基点突变绝大多数发生在该基因羧基端结构域和血影蛋白结合结构域,而“死亡”结构域的点突变鲜有报道。本课题前期临床研究发现一例LQT4患者,其ankyrin-B基因的点突变位于“死亡”结构域(第40号外显子)的第4603号碱基突变,即胸腺嘧啶取代了腺嘌呤(T4603A),导致第1535号氨基酸发生改变,即精氨酸取代了色氨酸(W1535R),作为调节结构域组成部分的“死亡”结构域点突变导致LQT4的发生机制尚不清楚。因此,在本研究旨在于探讨ankyrin-B基因“死亡”结构域点突变(ANKB-W1535R)导致LQT4的分子生物学机制。本实验分三部分。第一部分：确定心肌组织腺病毒在体转染方法的有效性。实验分为阴性对照组(group Ⅰ)、心肌多点注射组(group Ⅱ)、传统冠脉灌注组(group Ⅲ)和停搏后冠脉灌注组(group Ⅳ)。按照上述各方法转染后,观察各组转染效率的差异,并通过组织学方法观察心肌组织形态改变,Western blot法检测各组心外组织(肝、肾、肺)中腺病毒的表达量,以及停搏后冠脉灌注组心肌组织中腺病毒表达量随时间变化的关系。第二部分：在大体水平探讨转染ankyrin-B基因“死亡”结构域点突变(ANKB-W1535R)对大鼠心电及相关蛋白表达的影响。实验分为阴性对照组(control)、转染Ad-EGFP组(EGFP组)和转染Ad-EGFP-ANKB-W1535R (ANKB-W1535R组)。运用停搏后冠脉灌注法建立大鼠LQT4模型,观察ANKB-W1535R对大鼠心电图的影响；Western blot方法检测ANKB-W1535R对大鼠心肌组织的ANKB蛋白及其结合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、NCX1和IP3R蛋白表达量的影响。第三部分：在细胞水平研究转染ankyrin-B基因“死亡”结构域点突变(ANKB-W1535R)对大鼠心肌细胞Ca2+瞬变及相关蛋白表达和定位的影响。急性分离大鼠心肌细胞,实验分为阴性对照组(control)、转染Ad-EGFP组(EGFP组)和转染Ad-EGFP-ANKB W1535R (ANKB-W1535R组),并通过细胞免疫荧光方法观察ANKB-W1535R对心肌细胞ANKB蛋白及其结合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、 NCX1和IP3R蛋白表达量及定位的影响。结果第一部分：确定心肌组织腺病毒在体转染方法的有效性(一)各组大鼠心肌组织EGFP荧光强度及转染效率的比较荧光显微镜下阴性对照组心肌组织可见微弱的自发荧光。转染各组4日后大鼠心肌组织均有明显的绿色荧光,其中心肌多点注射组荧光分布不均,传统冠脉灌注组仅有点片状荧光,停搏后冠脉灌注组荧光均匀分布。传统冠脉灌注组转染效率最低(5.29±4.9%),分别与心肌多点注射组(61.9±9.7%)和停搏后冠脉灌注组(52.9±7.4%)相比差异有统计学意义(P<0.01),而心肌多点注射组与停搏后冠脉灌注组的转染效率相比差异无统计学意义(P>0.05)。(二)各组EGFP在左心室表达量的比较采用Western Blot分析各组EGFP在左心室的表达量,心肌多点注射组及停搏后冠脉灌注组的EGFP表达量显著强于传统冠脉灌注组(P<0.01),而心肌多点注射组及停搏后冠脉灌注组差异无统计学意义(P>0.05)。(三)各组大鼠心脏及心外组织(肾脏、肝脏、肝脏)中EGFP表达量的比较采用Western Blot分析各组EGFP在大鼠肾脏、肺脏、心脏及肝脏的表达量,心肌多点注射组和停搏后冠脉灌注组心脏的EGFP表达量显著高于肾、肺和肝的EGFP表达量(P<0.01)；而传统冠脉灌注组的肝脏的EGFP表达量则显著高于心、肾和肺的EGFP表达量(P<0.05),但心脏的EGFP表达量与肾和肺的EGFP表达量差异无统计学意义(P>0.05)。(四)停搏后冠脉灌注组各不同时间点EGFP表达量的比较停搏后冠脉灌注组的EGFP表达量随时间的延长而明显减弱。与阴性对照组相比,转染后4d组EGFP表达量显著增高(2.484±0.315,P<0.01)；与转染4d组相比,转染7d(0.234±0.040)、10d(0.132±0.038)及14d组(0.045±0.008)EGFP表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)；而与阴性对照组相比,转染后10、14d的EGFP表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。(五)不同转染方法对大鼠心肌组织形态结构的影响比较阴性对照组心肌细胞形态良好,结构完整,横纹清晰；心肌多点注射组心肌组织呈现大量炎性细胞浸润,且有部分心肌坏死；传统冠脉灌注组及停搏后冠脉灌注组心肌细胞形态良好,心肌组织结构完整,无炎性细胞浸润。第二部分：在大体水平探讨ANKB-W1535R时大鼠心电及相关蛋白表达量的影响(一)转染ANKB-W1535R对大鼠心电图的影响1、转染ANKB-W1535R对大鼠心电图形态的影响转染4d后,各组大鼠检测心电图,心电图形态均无显著变化。ANKB-W1535R组的1只大鼠在运动后心电图出现了偶发的心脏逸搏。腹腔注射肾上腺素模拟大鼠应激后,三组大鼠均无死亡。EGFP组在运动后心率加快,心电图形态无改变,而ANKB-W1535R组中3只大鼠在运动后心率加快(占42.9%),4只心率变异性高(占57.1%)。运动加应激后ANKB-W1535R组4只大鼠在应激5-15min后均出现了多形性室性心动过速,而阴性对照组及EGFP组大鼠在运动加应激后只出现心率增快,未出现心电图形态的变化。转染ANKB-W1535R对大鼠心电图QT间期(QTc)的影响：不同处理组之间心电图QTc差异有统计学意义(F=7.769, P=0.004)。ANKB-W1535R组QTc最高(206.99±32.70)ms。采用LSD两两比较可见,ANKB-W1535R组与阴性对照组(155.17±13.96)和EGFP组(168.83±21.91)相比,QTc差异有统计学意义(P值分别为0.002,0.014)；而阴性对照组与EGFP组相比,QTc差异无统计学意义(P=0.353)。转染ANKB-W1535R对大鼠心电图PR、QRS间期及P波的影响：不同处理组之间PR、QRS间期及P波差异均无统计学意义(F值分别为0.674,2.031,0.257；P值分别为0.524,0.164,0.777)。2、转染ANKB-W1535R对大鼠心率的影响运动加应激后,不同处理组之间心率差异无统计学意义(F=0.619,P=0.551)。ANKB-W1535R组大鼠在应激后25min内心率显示高度的变异性,心率最高时达586BPM,最低时只有248.62BPM。阴性对照组和EGFP组大鼠心率随时间的变化不大,阴性对照组心率在394BPM至430BPM之间变化,EGFP组心率在381BPM至478BPM之间变化。综上所述,转染ANKB-W1535R可以导致大鼠QTc延长、偶发心脏逸搏,应激后心率变异性增高、出现多形性室性心动过速,而这些均符合人类LQT4的心电图特点,因此,我们判断转染ANKB-W1535R建立LQT4模型成功。(二) Western blot测定ANKB、Na+/K+ATP α1/α2、NCX1和IP3R蛋白表达水平1、转染ANKB-W1535R对大鼠心肌组织ANKB表达量的影响：不同处理组之间ANKB表达量差异有统计学意义(F=6.382, P=0.033)。ANKB-W1535R组大鼠的ANKB蛋白表达水平最低(0.489±0.091),分别与阴性对照组(0.793±0.139)及EGFP组(0.764±0.110)相比差异有统计学意义(P值分别为0.018、0.026)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.766)。因此,转染ANKB-W1535R能导致ANKB表达量减少。2、转染ANKB-W1535R对大鼠心肌组织Na+/K+ATPase α1表达量的影响：不同处理组之间Na+/K+ATPase α1表达量差异有统计学意义(F=13.875, P=0.006)。ANKB-W1535R组大鼠的Na+/K+ATPase α1蛋白表达水平最低(0.620±0.119),分别与阴性对照组(1.291±0.193)及EGFP组(1.031±0.151)相比差异有统计学意义(P值分别为0.002、0.019)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.090)。因此,转染ANKB-W1535R能导致Na+/K+ATPα1表达量减少。3、转染ANKB-W1535R对大鼠心肌组织Na+/K+ATPase α2表达量的影响：不同处理组之间Na+/K+ATPase α2表达量差异有统计学意义(F=5.665,P=0.042). ANKB-W1535R组大鼠的Na+/K+ATPase α1蛋白表达水平最低(0.101±0.021),分别与阴性对照组(0.196±0.040)及EGFP组(0.201±0.055)相比差异有统计学意义(P值分别为0.030、0.024);阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.883)。因此,转染ANKB-W1535R能导致Na+/K+ATPa2表达量减少。4、ANKB-W1535R对大鼠心肌组织NCX1表达量的影响：不同处理组之间NCX1表达量差异有统计学意义(F=7.033, P=0.027). ANKB-W1535R组大鼠的NCX1蛋白表达水平最低(0.370±0.151),分别与阴性对照组(0.741±0.141)及EGFP组(0.694±0.098)相比差异有统计学意义(P值分别为0.014、0.024)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.682)。因此,转染ANKB-W1535R能导致NCX1表达量减少。5、转染ANKB-W1535R对大鼠心肌组织IP3R表达量的影响：不同处理组之间IP3R表达量差异有统计学意义(F=6.511, P=0.031). ANKB-W1535R组大鼠的IP3R蛋白表达水平最低(0.530±0.125),分别与阴性对照组(1.037±0.188)及EGFP组(0.960±0.228)相比差异有统计学意义(P值分别为0.015、0.030)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.629)。因此,转染ANKB-W1535R能导致IP3R表达量减少。第三部分：在细胞水平探讨转染ANKB-W1535R对大鼠心肌细胞Ca2+瞬变及相关蛋白表达和定位的影响(一)心肌细胞重组腺病毒载体的转染效率急性分离的心肌细胞成活率可达80%以上。在心肌细胞用重组腺病毒载体转染48h后,细胞存活率达70%以上,转染效率约为100%。(二)心肌细胞ANKB、Na+/K+ATP α1/α2、NCX1及IP3R的免疫荧光染色1、ANKB免疫荧光染色结果：阴性对照组和EGFP组心肌细胞的ANKB沿细胞横管(T管)区域呈条形分布,荧光清晰明亮。而ANKB-W1535R组ANKB分布紊乱,荧光强度最弱(29.441±4.474),分别与阴性对照组(52.425±7.619)及EGFP组(48.762±6.573)相比有显著差异(P值分别为0.004、0.010)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.507)。2、Na+/K+ATP α1免疫荧光染色结果：阴性对照组和EGFP组心肌细胞的Na+/7K+ATP α1在细胞膜及横管(T管)区域均有染色,荧光清晰明亮。而ANKB-W1535R组Na+/K+ATP α1分布紊乱,荧光强度最弱(16.110±3.640),分别与阴性对照组(42.083±1.637)及EGFP组(44.363±7.345)相比有显著差异(P值分别为0.008、0.006)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.746)。3. Na+/K+ATP α2免疫荧光染色结果：阴性对照组和EGFP组心肌细胞的Na+/K+ATP α2沿细胞横管(T管)区域呈条形分布,荧光清晰明亮。而ANKB-W1535R组Na+/K+ATPα2分布紊乱,荧光强度最弱(23.191±2.997),分别与阴性对照组(42.029±7.672)及EGFP组(45.202±8.269)相比有显著差异(P值分别为0.007、0.014)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.585)。4、NCX1免疫荧光染色结果：阴性对照组和EGFP组心肌细胞的NCX1沿细胞横管(T管)区域呈条形分布,荧光清晰明亮。而ANKB-W1535R组NCX1分布紊乱,荧光强度最弱(10.219±3.330),分别与阴性对照组(42.582±7.197)及EGFP组(39.483±5.372)相比有显著差异(P值分别为0.000、0.001)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.518)。5、IP3R免疫荧光染色结果：阴性对照组和EGFP组心肌细胞的IP3R沿细胞横管(T管)区域呈条形分布,荧光清晰明亮。而ANKB-W1535R组IP3R分布紊乱,荧光强度最弱(12.386±3.862),分别与阴性对照组(40.514±5.659)及EGFP组(40.509±9.610)相比有显著差异(P值均为0.002)；阴性对照组与EGFP组相比差异无统计学意义(P=0.999)。综上所述,转染ANKB-W1535R能导致ANKB及其结合蛋白Na+/K+ATP α1/α2、NCX1及IP3R表达量减少,并减弱这些蛋白在横管靶向定位功能。(三)心肌细胞Ca2+瞬变不同处理组心肌细胞的收缩性(场刺激引起细胞长度缩短的最大值与收缩前长度的比值)：阴性对照组为(9.21±1.23)%,EGFP组为(9.20±1.50)%,ANKB-W1535R组为(8.97±0.99)%,各组相比差异无统计学意义(F=1.348,P=0.261),说明心肌细胞的收缩性并未受影响；ANKB-W1535R组Ca2+瞬变峰值(ΔF/F0)最高(1.43±0.14),与阴性对照组(1.03±0.19)和EGFP组(0.98±0.21)相比,差异有统计学意义(P值分别为0.036,0.023)；不同处理组的Ca2+瞬变上升时间(rise time)差异无统计学意义(F=1.384,P=0.252)；不同处理组的Ca2+瞬变半数衰减时间(FDHM)差异显著(F=79.19,P=0.000),与阴性对照组(129.87±11.91ms)及EGFP组为(126.59±13.77ms)相比,ANKB-W1535R组(153.64±23.40ms)的FDHM最高(P值均为0.000),说明Ca2+回收机制受损。结论1、改良过的停搏后冠脉灌注法应用于转染大鼠心肌细胞,具备较高转染效率、转染分布均匀、心外组织转染量少、存活率较高及对心肌组织无损害等特点,可作为大鼠心肌细胞在体转染的一种较好的可选方法；2、在大体水平上,转染ANKB-W1535R可以引起大鼠LQT4心律失常,ANKB-W1535R引起ANKB、Na+/K+ATPα1/α2、NCX1及IP3R蛋白表达量下降及定位紊乱可能是导致LQT4大鼠心律失常的原因之一；3、在细胞水平上,细胞内Ca2+瞬变增高可能是LQT4大鼠心律失常的原因之一。