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研究的目的和意义：肺癌严重危害人类健康是目前世界上最常见的恶性肿瘤,在恶性肿瘤所致的死亡中居首位,造成极大的疾病负担。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理类型,占所有肺癌病例的80%以上。随着综合治疗模式以及分子生物化学的发展,NSCLC的疗效有所提高,但预后仍不理想,5年总生存率不到20%。微小核糖核酸(miRNA)是一类广泛存在的非编码蛋白的小分子RNA, miRNA表达及调控失衡在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。近年来,随着对microRNA研究的深入,越来越多的研究显示miRNA在肺癌的发展过程中占有重要的地位。其中miR-34b-5p被证实与NSCLC的发生和发展密切相关。目前中医药在临床上治疗肿瘤已取得显著疗效,相比于西医治疗肿瘤,中医在抑制肿瘤转移和迁移,防止肿瘤复发,稳定瘤体,改善患者全身症状,提高患者生活质量等方面具有明显优势。“周氏克金岩方”是国医大师周仲瑛教授通过长期临床实践总结由养阴益气、活血祛瘀、燥湿化痰、软坚散结等四类功效药物组成的治疗肺癌的有效方剂。经高通量筛选,得到对非小细胞肺癌(NSCLC)有细胞毒作用的单体靶点有20余种,包括麦冬皂苷、异甘草素、槲皮素、人参皂苷和联苄类化合物等单体化合物。在这张抗肺癌方剂中,麦冬皂苷B (Ophiopogonin B, OP-B)作为一味不可或缺的中药组分,具有显著的体外抗癌作用,但其相关机理有待进一步研究。本实验通过检测感染过表达慢病毒LV-hsa-miR-34b的A549细胞以及加入了OP-B的A549细胞中miR-34b-5p及Met的表达,来揭示OP-B抗NSCLC的可能机制。方法：通过阅读相关文献,挑选出数个对非小细胞肺癌A549细胞有影响的miRNA,通过Real-time PCR技术从中筛选出加入麦冬皂苷B后差异表达的miRNA,以此miRNA为靶点,通过Real-time PCR技术比较其在正常胚胎肺成纤维细胞MRC-5细胞以及A549细胞中的表达量,鉴定其在非小细胞肺癌A549的表达特性,判断其发挥的作用。构建hsa-miR-34b过表达慢病毒载体,用重组质粒pHLV-miR-34b感染A549细胞并鉴定转染效率。通过常用的TargetScans、PicTar和PITA等靶基因预测软件预测miR-34b的潜在靶基因。通过Real-time PCR以及Western Blot技术从基因水平以及蛋白水平验证miR-34b-5p和OP-B对Met的影响,通过划痕实验和transwell实验验证miR-34b-5p对A549细胞迁移和侵袭的影响,以期揭示OP-B可能的抗癌机制。结果：1. Real-time PCR结果显示加入药物前后miR-21-5p、miR-148a-3p、miR-29a-3p、 miR-338-5p、miR-125a-5p的表达变化不明显,而miR-34b-5p的表达变化显著,明显升高,说明麦冬皂苷B能影响A549细胞中miR-34b-5p的表达。2. Real-time PCR显示正常胚胎肺成纤维细胞MRC-5细胞中miR-34b-5p的表达量明显高于非小细胞肺癌A549细胞,说明miR-34b-5p在非小细胞肺癌中发挥抑癌的作用。3. hsa-miR-34b过表达慢病毒载体的构建及效率鉴定的实验,通过基因测序显示miR-34b的基因正确地插入到了载体pHLV中,Real-time PCR显示转染后的细胞miR-34b-5p的表达量明显升高,荧光镜下可见发光蛋白,说明重组慢病毒质粒成功感染A549细胞。4.通过查阅相关文献并利用生物学靶基因预测软件分析,发现miR-34b预测的靶基因中包括met,且提示met可能是miR-34b-5p的关键下游靶基因。5. Real-time PCR以及Western Blot结果示Micro-up组和OP-B组细胞Met的表达低,而A549组和NC组Met的表达高。6.划痕实验和transwell实验结果显示Micro-up组细胞迁移和侵袭慢,而NC组细胞迁移和侵袭快。结论：1.麦冬皂苷B能显著降低非小细胞肺癌A549细胞中miR-34b-5p的表达水平。2. miR-34b-5p在非小细胞肺癌A549细胞中表达下调,发挥抗癌作用。3.met是miR-34b-5p的靶标基因。4.外源性上调miR-34b-5p的表达,可在基因和蛋白水平下调Met的表达；加入麦冬皂苷B,也可在基因和蛋白水平下调Met的表达。麦冬皂苷B可能通过上调A549细胞miR-34b-5p表达,进而抑制下游靶基因met的表达而发挥抗癌作用。5.外源性上调miR-34b-5p的表达,可抑制A549细胞的迁移和侵袭。