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目的:为了更为直观地观测到不同株系的布鲁氏菌在侵染同一宿主细胞与宿主个体时两者的能力差别与相互影响,本试验旨在通过重叠延伸PCR技术,改造绿色荧光蛋白布鲁氏菌真核表达载体pMC-221-GFP,获得红色荧光蛋白布鲁氏菌真核表达载体pMC-221-RFP;利用电转化获得在真核条件下稳定表达绿色荧光蛋白的布鲁氏菌M5株系（以下简称M5-pMC-221-GFP）与能够稳定表达红色荧光蛋白的布鲁氏菌16M株系（以下简称16M-pMC-221-RFP）;通过联合M5-pMC-221-GFP与16M-pMC-221-RFP两种布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞的研究,激光共聚焦显微镜下我们可以鉴别出布鲁氏菌M5株系与布鲁氏菌16M株系在侵染同一宿主细胞时的能力差别与相互影响。同时,本试验为后续其他种类布鲁氏菌的联合研究,提供了可视工具,奠定了坚实的基础。方法:1、本试验以PCR的方法分别获得了带有重叠延伸区间的核糖体结合位点-红色荧光蛋白片段（以下简称RBS-RFP片段）与布鲁氏菌特异DNA片段（以下简称BDNA片段）,通过优化重叠延伸PCR的反应条件连接上述两个片段获得RBS-RFP-BDNA重叠片段,将RBS-RFP-BDNA重叠片段连接pLB载体,利用Sma I与Sac II对重组载体进行双酶切,将酶切的胶回收产物与pMC-221-GFP质粒经相同两种酶双酶切所获得的片段连接,转化大肠杆菌,获得p MC-221-RFP质粒。2、本试验利用电转化的方法分别将本实验室保存的p MC-221-GFP质粒与本试验改造获得的p MC-221-RFP质粒分别转化布鲁氏菌M5株系与布鲁氏菌16M株系,抗性筛选与菌液PCR鉴定获得M5-pMC-221-GFP与16M-pMC-221-RFP阳性株系。3、将M5-pMC-221-GFP与16M-pMC-221-RFP两种布鲁氏菌株系分别连续培养至F10代,麦氏比浊管确定菌液浓度,按照布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞比例为100:1的比例进行侵染试验,确定布鲁氏菌中荧光表达的稳定性。4、将M5-pMC-221-GFP与16M-pMC-221-RFP两种布鲁氏菌株系以等比例混匀,按照布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为100:1的比例进行侵染试验,将侵染6 h的小鼠巨噬细胞制成细胞爬片,激光共聚焦检测荧光表征。5、将M5-pMC-221-GFP按照布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为50:1的比例侵染3 h,接下来向侵染后的细胞培养皿中加入等量16M-pMC-221-RFP布鲁氏菌株系继续侵染3 h。侵染完成后将小鼠巨噬细胞制成细胞爬片,激光共聚焦检测荧光表征。6、将16M-pMC-221-RFP按照布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为50:1的比例侵染3 h,接下来向侵染后的细胞培养皿中加入等量M5-pMC-221-GFP布鲁氏菌株系继续侵染3 h。侵染完成后将小鼠巨噬细胞制成细胞爬片,激光共聚焦检测荧光表征。结果:1、运用优化条件后的重叠延伸PCR技术,本试验成功获得了红色荧光蛋白布鲁氏菌真核表达载体pMC-221-RFP。2、运用电转化技术,本试验成功获得了能够在真核条件下表达绿色荧光蛋白的布鲁氏菌M5株系M5-pMC-221-GFP和能够表达红色荧光蛋白的布鲁氏菌16M株系16M-pMC-221-RFP。3、运用连续培养到F10代的M5-p MC-221-GFP与16M-pMC-221-RFP进行小鼠侵染实验,激光共聚焦检测细胞荧光表征,结果显示被M5-pMC-221-GFP侵染的小鼠巨噬细胞能够稳定表达绿色荧光蛋白,被16M-pMC-221-RFP侵染的小鼠巨噬细胞能够稳定表达红色荧光蛋白。4、M5-pMC-221-GFP与16M-pMC-221-RFP两种布鲁氏菌以等比例混匀侵染小鼠巨噬细胞,激光共聚焦图片显示28%的细胞中单一出现红色荧光,69%的细胞单一出现绿色荧光,3%的细胞中同时出现了红色荧光与绿色荧光,有红绿重叠的橙黄色区域出现。5、M5-pMC-221-GFP先侵染小鼠巨噬细胞,随后加入16M-pMC-221-RFP完成侵染,激光共聚焦图片显示,所有的细胞中都会出现绿色荧光,但是有11%的细胞会同时出现红色荧光与绿色荧光,有红绿重叠的橙黄色区域出现。6、16M-pMC-221-RFP先侵染小鼠巨噬细胞,随后加入M5-pMC-221-GFP完成侵染,激光共聚焦图片显示所有的图片都只有红色荧光出现。结论:1、本试验成功构建了pMC-221-RFP质粒,与pMC-221-GFP联用,通过电转获得了能够在真核环境稳定表达绿色荧光蛋白的M5-pMC-221-GFP与能够稳定表达红色荧光蛋白的16M-p MC-221-RFP。2、本试验研究证实:布鲁氏菌M5株系与16M株系同时侵染多个小鼠巨噬细胞时,97%的细胞只会被单一种类的布鲁氏菌侵染成功,且布鲁氏菌16M株系的侵染能力约为布鲁氏菌M5株系的2.5倍,但同时也会出现3%的小鼠巨噬细胞能同时被两种布鲁氏菌侵染成功的现象。3、本试验研究证实:布鲁氏菌M5株系与16M株系依次先后侵染小鼠巨噬细胞时,所有的细胞都会被布鲁氏菌M5株系成功侵染,随后有11%的小鼠巨噬细胞在被布鲁氏菌M5株系成功侵染后依然能够被布鲁氏菌16M株系继续侵染。4、本试验研究证实:布鲁氏菌16M株系与M5株系依次先后侵染小鼠巨噬细胞时,所有的细胞都会被布鲁氏菌16M株系成功侵染,但是所有的被侵染细胞都不能够继续被布鲁氏菌M5株系成功侵染。