1研究背景血管衰老是心血管疾病的首要危险因素。在血管衰老的基础上,衰老相关心血管疾病的发生率和严重程度明显增加。多种病理生理学机制参与血管衰老的形成过程,影响血管壁细胞和细胞外基质重构,并最终导致血管弹性减弱、僵硬度增加。大量证据表明细胞衰老在血管衰老以及衰老相关心血管疾病的发生发展过程中发挥重要作用。在血管衰老动脉模型、人动脉粥样硬化斑块、缺血性心肌病患者冠状动脉粥样硬化斑块中均发现有衰老细胞的存在。并且在对提取自动物衰老血管以及人动脉粥样硬化斑块的血管细胞进行体外培养时发现细胞表现出生长受限和较早进入衰老状态的特征。衰老细胞代谢异常、凋亡增加,引起血管壁细胞和细胞外基质成分的改变,促进了血管衰老形成和血管僵硬度增加。随着年龄的增长,男性雄激素水平逐渐降低。研究表明低睾酮水平与男性心血管疾病高发密切相关,并且低睾酮水平与男性血管衰老的表现如颈动脉内中膜增厚、主动脉钙化、动脉粥样硬化等相关。睾酮替代治疗能够改善衰老相关的血管病变,改善多种心血管危险因素。提示睾酮替代治疗具有广泛的心血管益处,但其机制尚不清楚。近年来,睾酮改善细胞衰老的作用受到关注。研究表明睾酮能够改善快速老化小鼠海马内皮细胞和神经元细胞衰老,改善阿霉素诱导的心肌细胞衰老。但是,睾酮与血管衰老和细胞衰老的关系还尚未完全阐明。Gas6是由生长停滞特异性基因6所编码的一种分泌型蛋白,隶属于维生素K依赖性蛋白家族。Gas6通过与TAM酪氨酸受体家族结合发挥生物学功能,该受体家族包含三个成员Tyro3、Axl和Mer,其中Tyro3主要分布于脑及中枢神经系统中,Mer仅存在于单核细胞中,Axl分布广泛,并且与Gas6的结合能力最强,介导了Gas6的大部分生物学功能,因此常被称为Gas6/Axl信号通路。大量研究表明Gas6/Axl通路参与了多项心血管疾病的病理生理过程,例如血管损伤修复、钙化、动脉粥样硬化形成、血栓形成等。并且,Gas6基因多态性与急性冠脉综合征及脑卒中密切相关。临床研究表明血清Gas6水平随着年龄增长而降低,并且与血清睾酮水平相关。随着研究的深入,Son等人在体外证实睾酮能够促进Gas6表达,并在Gas6启动子序列上发现有功能的雄激素受体结合位点,睾酮能够通过该位点调节gas6基因的转录过程。并且我们前期研究发现,Gas6/Axl通过对周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制物p16、p21、p27的调节促进细胞周期G1/S期转位从而发挥抗VSMCs衰老的作用。尽管Gas6/Axl在心血管系统中具有重要作用,并兼具接受雄激素调控和延缓细胞衰老的特点,但是Gas6/Axl是否参与睾酮对血管细胞衰老的调节还不清楚。鉴于Ang Ⅱ在促进血管衰老和细胞衰老过程中的重要作用,本研究将选用Ang Ⅱ建立VSMCs诱导衰老模型,探讨睾酮对Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老的影响,及Gas6/Axl通路在睾酮改善VSMCs衰老中的作用。2研究目的(1)采用Ang Ⅱ建立VSMCs诱导衰老模型,探讨睾酮对VSMCs衰老的保护作用；(2)探讨Gas6/Axl/Akt/FoxO信号转导通路在睾酮改善VSMCs衰老过程中的作用。3研究方法3.1原代小鼠血管平滑肌细胞提取和培养选取8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠6只,脱颈处死并消毒后转移至超净台内。无菌条件下将主动脉剥离下来并去除外膜,将中膜剪成1 mm2大小的组织块,然后将剪碎的组织块均匀平铺于培养瓶底部。将培养瓶垂直放置于37℃细胞培养箱中贴壁,此过程大约需要120 min。组织块贴壁之后,加DMEM/F12培养基进行培养,绝对静置3天。3-5天后进行换液,此时可有少量细胞长出。之后每2-3天换液一次,7-10天后可见大量细胞长出。3.2 VSMCs诱导衰老模型的建立选用P3-5代的小鼠VSMCs种于6孔板中,用10-6M Ang Ⅱ刺激48小时建立小鼠VSMCs诱导衰老模型。3.3 VSMCs诱导衰老模型的鉴定采用Western blot检测p16INK4a和p21Cipl的表达和β-半乳糖苷酶染色的方法来检测VSMCs衰老情况。3.4 β-半乳糖苷酶染色控制实验结束时细胞密度在70～80%左右,固定液固定后,用p-Gal染液在无C02的37℃恒温箱中孵育过夜,染色结束后用倒置相差显微镜进行观察并拍照保存。3.5 Western blot检测实验结束后,提取细胞总蛋白,Western blot检测小鼠血管平滑肌细胞内Gas6、Axl、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 MT1-MMP、p-Akt、Akt、p-FoxO1a、FoxO1和β-actin蛋白表达。3.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测实验结束后,收集细胞培养上清液,ELISA检测细胞上清液中Gas6蛋白含量。3.7明胶酶谱检测实验结束后,收集细胞培养上清液,明胶酶谱法检测MMP-2酶活性。3.8 siRNA转染实验FoxO1a-siRNA转染所用细胞为MOVAS细胞系,转染时间为6小时,转染结束后进行后续实验。3.9统计学分析所有结果均以均数±标准差表示。所有统计学分析均采用SPSS 20.0统计软件进行。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用One-way ANOVA统计方法进行。P<0.05作为差异有统计学意义。4研究结果4.1睾酮最适作用浓度和作用时间的筛选与对照组相比,睾酮浓度在30和300nM时能明显降低衰老相关p16INK4a和P21cipl的表达。与对照组相比,30 nM睾酮在24、36、48小时时能显著降低p16INK4a和p21Cip1的表达。因此选择30 nM,24 h作为睾酮最适作用浓度和时间用于后续实验。4.2睾酮对Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老的影响与对照组相比,Ang Ⅱ (10-6 M,48 h)能够显著增加p16INK4a和p21CipI的表达和p-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮能够显著降低Ang Ⅱ诱导的p16INK4a和p21Cipl的表达和β-半乳糖苷酶活性。4.3 Ang Ⅱ对Gas6/Axl表达的影响与对照组相比,Ang II显著降低VSMCs中Gas6和Axl蛋白表达和细胞上清液中Gas6含量。4.4睾酮对Gas6/Axl表达的影响睾酮能够浓度和时间依赖性促进Gas6/Axl的表达。与对照组相比,30、300 nM睾酮能够显著增加Gas6/Axl的表达。与对照组相比,睾酮干预24、36、48 h能够显著增加Gas6/Axl的表达。4.5 Gas6中和抗体Axl-Fc对睾酮改善VSMCs衰老的影响与对照组相比,Axl-Fc能够显著增加p16INK4a和p21Cipl表达,以及p-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量。与Ang 11+睾酮干预组相比,Axl-Fc能够明显阻断睾酮降低p16INK4a和p21Cip1表达的作用。4.6 Axl阻断剂R428对皋酮改善VSMCs衰老的影响与对照组相比,R428能够显著增加p16INK4a和p21Cipl表达,以及p-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量。与Ang Ⅱ+睾酮干预组相比,R428能够明显阻断睾酮降低p16INK4a和P21cipl表达的作用。4.7睾酮减少Ang Ⅱ诱导的胶原Ⅰ/Ⅲ的表达与对照组相比,Ang Ⅱ能够显著增加胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮干预能够显著降低Ang Ⅱ诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。4.8 Axl-Fc对睾酮降低胶原Ⅰ/Ⅲ表达的影响与对照组相比,Axl-Fc能够显著增加胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达。与Ang Ⅱ+睾酮干预组相比,Axl-Fc能够明显阻断睾酮减少胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的作用。4.9 R428对睾酮降低胶原Ⅰ/Ⅲ表达的影响与对照组相比,R428能够显著增加胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达。与Ang Ⅱ+睾酮干预组相比,R428能够明显阻断睾酮减少胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的作用。4.10睾酮对Ang Ⅱ诱导的MMP-2表达和活性的影响与对照组相比,Ang Ⅱ显著增加MMP-2表达和活性。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮能够显著降低Ang Ⅱ诱导的MMP-2表达和活性。与对照组相比,Ang Ⅱ能够显著增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,减少TIMP-2表达。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮能够显著降低MT1-MMP的表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,升高TIMP-2表达。4.11 Axl-Fc对睾酮调节MMP-2表达和活性的影响与对照组相比,Axl-Fc显著增加MMP-2表达和活性。与睾酮刺激组相比,Axl-Fc明显阻断睾酮降低MMP-2表达和活性的作用。与对照组相比,Axl-Fc能够显著增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,降低TIMP-2表达。与睾酮干预组相比,Axl-Fc能够明显阻断睾酮降低MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值和升高TIMP-2表达的作用。4.12 R428对睾酮调节MMP-2表达和活性的影响与对照组相比,R428显著增加MMP-2表达和活性。与睾酮刺激组相比,R428明显阻断睾酮降低MMP-2表达和活性的作用。与对照组相比,R428能够显著增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,降低TIMP-2表达。与睾酮刺激组相比,R428能够明显阻断睾酮降低MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值和升高TIMP-2表达的作用。4.13睾酮对Akt/FoxO信号通路的影响与对照组相比,Ang Ⅱ刺激组Akt和FoxO1a磷酸化水平降低。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮干预组Akt和FoxO1a磷酸化水平明显升高。4.14 Axl-Fc对睾酮调节Akt/FoxO磷酸化水平的影响与对照组相比,Axl-Fc显著降低Akt和FoxOla磷酸化水平。与睾酮刺激组相比,Axl-Fc明显阻断睾酮升高Akt和FoxO1a的磷酸化水平的作用。4.15 R428对睾酮调节Akt/FoxO磷酸化水平的影响与对照组相比,R428显著降低Akt和FoxO1a磷酸化水平。与睾酮刺激组相比,R428明显阻断睾酮升高Akt和FoxO1a磷酸化水平的作用。4.16 Akt在睾酮调节MMP-2表达和活性中作用与对照组相比,LY294002显著增加MMP-2表达和活性。与Ang Ⅱ+睾酮组相比,Ang Ⅱ+睾酮+LY294002组MMP-2表达和活性都显著升高。与对照组相比,LY294002显著增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,降低TIMP-2表达。与Ang Ⅱ+睾酮组相比,Ang Ⅱ+睾酮+LY294002组MT1-MMP表和MT1-MMP/TIMP-2比值显著升高,TIMP-2表达显著降低。4.17 Fox01a-siRNA的转染效率与对照组相比,FoxO1a-siRNA干扰组FoxO1a蛋白表达明显减低。FoxO1a-siRNA对FoxO1a蛋白的抑制率达到70%左右。4.18 FoxO在睾酮调节MMP-2表达和活性中作用与对照组相比,FoxO1a-siRNA干扰组MMP-2表达和活性均明显降低。与Ang Ⅱ刺激组相比,Ang !+FoxO1a-siRNA干扰组的MMP-2表达和活性均明显降低。MMP-2表达和活性在Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰组、Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰+睾酮干预组和Ang Ⅱ+睾酮干预组之间没有统计学差异。与对照组相比,FoxO1a-siRNA干扰组MT1-MMP表达,MT1-MMP/TIMP-2比值明显降低,TIMP-2表达显著升高。与Ang Ⅱ刺激组相比,Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰组MT1-MMP表达,MT1-MMP/TIMP-2比值明显降低,TIMP-2表达显著升高。MT1-MMP和TIMP-2表达以及MT1-MMP/TIMP-2比值在Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰组、AngⅡ+FoxO1a-siRNA干扰组+睾酮干预组以及Ang Ⅱ+睾酮干预组之间没有统计学差异。4.19 Akt在睾酮延缓VSMCs衰老中的作用与对照组相比,PI3K抑制剂LY294002能够促进P16INK4a和p21Cip1表达；与睾酮组相比,睾酮+LY294002组p16INK4a和p21CipI表达显著增加;与Ang Ⅱ+睾酮组相比,Ang Ⅱ+睾酮+LY294002组p16INK4a和P21Cipl表达显著增加。与LY294002 对 p16INK4a表达的调节作用相比,LY294002对p21Cipl表达的调节作用更强。5结论(1)睾酮能够改善Ang Ⅱ诱导的小鼠VSMCs衰老和胶原代谢异常；(2) Gas6/Axl在睾酮延缓Ang Ⅱ诱导的小鼠VSMCs衰老和抑制胶原合成过程中发挥重要作用；(3) Akt/FoxO1a参与了睾酮延缓Ang Ⅱ诱导的小鼠VSMCs衰老和胶原合成过程。1研究背景血管衰老是心血管疾病的独立危险因素和危险性预测因子。随着人民平均寿命的延长和老龄化的加剧,血管衰老的发生率呈逐年上升的趋势。在血管衰老的基础上,动脉粥样硬化、高血压、脑卒中等心血管疾病的发病率和严重程度明显增加。血管衰老的程度在很大程度上决定着老年人心血管系统的健康状况。尽管血管衰老的发生率在逐年升高,并且与衰老相关心血管疾病关系密切,但是血管衰老发生发展的机制仍所知甚少。血管衰老,即使在不合并动脉粥样硬化的情况下,也会引起大动脉管腔扩张、内中膜厚度增加以及弹性的逐渐丧失,而这些改变最终将引起动脉僵硬度增加、单纯收缩压升高、脉压增大以及舒张压的不变或降低。血管的弹性与血管中细胞外基质成分的构成密切相关。血管中细胞外基质成分主要包括胶原、弹力纤维、糖蛋白、蛋白多糖等,其中胶原和弹力纤维的相对含量是决定血管弹性的主要因素。正常情况下,大动脉富有弹性,动脉壁中弹力纤维含量较高、胶原含量较少。衰老可引起动脉壁胶原沉积增多,弹力纤维破坏增加,以及其它细胞外基质成为如整合素、纤维连接蛋白等的增多,这些改变都将促进动脉僵硬度增加。近年来,研究表明细胞衰老在血管衰老发生发展过程中发挥重要作用,细胞衰老的改变情况与血管衰老的程度存在一致性。研究发现,老年人动脉壁中衰老VSMCs合成和分泌基质金属蛋白酶增多,衰老内皮细胞合成和分泌纤维连接蛋白增多。另有研究表明,衰老内皮细胞和VSMCs凋亡增加,而衰老成纤维细胞凋亡减少。衰老细胞的这一系列变化共同引起血管壁中细胞和细胞外基质成分的改变,进而促进血管重构和血管衰老形成。雄激素是维持男性生理健康的重要激素。随着人口老龄化的加剧,将会有越来越多的男性面临雄激素不足的问题。研究认为,睾酮撤退是男性心血管疾病的独立危险因素之一。研究表明低睾酮水平与血管僵硬度增加密切相关,并且在年轻男性以及伴随有血压升高的男性相关性更强。低睾酮水平还与中老年男性颈动脉内中膜厚度增加、颈动脉粥样硬化斑块形成以及冠心病等衰老相关心血管疾病密切相关。睾酮替代治疗能够改善衰老相关的血管病变,改善多种心血管危险因素,提示睾酮替代治疗具有心血管益处,但遗憾的是睾酮改善血管硬化的分子病理学机制仍所知甚少。近年来,睾酮改善细胞衰老的作用被发现。研究表明睾酮具有改善快速老化小鼠海马内皮细胞和神经元细胞衰老,改善阿霉素诱导的心肌细胞衰老的作用。我们在论文Ⅰ中也证实了睾酮改善Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老的作用,并证实Gas6/Axl信号通路在睾酮延缓VSMCs衰老过程中起关键作用。Gas6是由生长停滞特异性基因编码的一种分泌型蛋白,通过与其受体Axl结合发挥其生物学功能。Gas6/Axl在心血管系统中具有广泛的作用,参与血管损伤修复、动脉粥样硬化和钙化形成等多个过程。另外,基因多态性分析显示,gas6基因与急性冠脉综合征以及脑卒中关系密切。研究还发现,Gas6是睾酮的下游效应分子,血清Gas6水平随着年龄和睾酮水平的变化而变化。并且Son等人在Gas6启动子序列上发现了雄激素受体(AR)结合位点,睾酮能够通过AR对Gas6进行调控。我们在论文Ⅰ中也进一步证实了睾酮能够浓度和时间依赖性促进VSMCs合成和分泌Gas6。综上所述,Gas6/Axl信号通路可能通过改善细胞衰老、减轻细胞外基质重构,在睾酮改善血管衰老和血管重构过程中发挥关键作用,但目前尚未见类似报道。因此,我们利用自然衰老的方法建立WT和Axl-/-衰老模型,观察十一酸睾酮(TU)替代治疗对血管衰老的影响,并探讨Gas6/Axl信号通路在TU替代治疗改善血管衰老中的作用以及可能的机制。2研究目的(1)探讨TU替代治疗对血管衰老及血管重构的影响；(2)探讨Axl在TU调节血管衰老和血管重构中的作用；(3)明确TU替代治疗及Axl基因敲除对下游信号分子Akt/FoxO1a磷酸化水平的影响。3研究方法3.1小鼠衰老模型的建立及雄激素的给予90只雄性WT小鼠和90只雄性Axl-/-小鼠分别随机分为3组：年轻组(n=30,3月龄),衰老组(n=30,18月龄),睾酮替代治疗组(n=30,18月龄)。睾酮替代治疗组于15月龄开始给予十一酸睾酮(37.9mg/Kg)颈背部注射,每月一次,一共三次。衰老组于15月龄开始给予溶媒试剂颈背部注射,方法同睾酮替代治疗组。实验结束后留取标本。3.2超声检测分别于3月龄、15月龄和18月龄行颈动脉和腹主动脉超声检查。检测指标包括内中膜厚度(IMT),收缩期内径(Ds),舒张期内径(Dd)和血流速度等。3.3血压检测分别于3月龄、15月龄和18月龄采用小动物尾部血管检测仪监测收缩压、舒张压、平均动脉压和心率等指标。3.4 Western blot检测提取组织总蛋白,Western blot检测小鼠主动脉Gas6、Axl、p16INK4a、 p21Cip1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、MT1-MMP、p-Akt、Akt、p-FoxO1a、FoxO1和P-actin的蛋白表达。3.5实时定量PCR检测提取小鼠主动脉总RNA,采用实时定量荧光PCR技术检测Gas6、Axl和β-actin的mRNA表达水平。3.6端粒长度的测量提取小鼠主动脉总DNA,采用实时定量荧光PCR技术检测相对端粒长度。3.7酶联免疫吸附试验(EL ISA)检测实验结束后,采用心脏取血的方法留取血清,ELISA检测血清睾酮和Gas6水平。3.8组织病理学检测对小鼠主动脉分别进行HE染色、Masson染色、天狼猩红染色和Verhoeff染色,并统计主动脉中膜胶原和弹力蛋白的含量以及弹力板断裂情况。3.9免疫组织化学染色采用免疫组织化学染色的方法检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP-2和MMP-9的表达和分布情况。3.10明胶酶谱采用无蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液提取主动脉总蛋白,利用明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9酶活性。3.11统计分析方法所有结果均以均数±标准差表示。所有统计学分析均采用SPSS 20.0统计软件进行。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用One-way ANOVA方法进行。P<0.05作为差异有统计学意义。4研究结果4.1衰老动物中睾酮和Gas6/Axl表达的改变与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组血清睾酮和Gas6水平显著降低。与WT和Axl-/-衰老组相比,WT和Axl-/- TU替代治疗组血清睾酮和Gas6水平明显升高。与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组小鼠主动脉Gas6明显降低。与WT和Axl-/-衰老组相比,WT和Axl-/-TU替代治疗组Gas6表达明显升高。与WT年轻组相比,WT衰老组小鼠主动脉Axl表达明显降低。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组Axl表达明显升高。Axl-/-基因敲除组Axl表达处于低水平。4.2 TU通过Axl改善血管细胞衰老与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组相对端粒长度明显缩短。与WT衰老组相比,WTTU替代治疗组相对端粒长度轻微延长。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组相对端粒长度无明显改变。与WT和Axl-/-年轻对照组相比,WT和Axl-/-衰老组p16INK4a和p21Cip1表达显著升高。与WT衰老组相比,WTTU替代组p16INK4a和p21Cip1表达明显降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组p16INK4a和p21Cip1表达升高更明显。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组p16INK4a和p21Cip1表达无明显改变。4.3 TU替代治疗和Axl基因敲除对衰老血管结构的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组颈动脉和腹主动脉内种膜厚度(IMT)、收缩期内径(Ds)和舒张期内径(Dd)明显增加、扩张幅度(CD)明显减小。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组CD降低更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉IMT减小、CD增大、Ds和Dd变化不明显。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉IMT、 CD、Ds和Dd变化均不明显。4.4 TU替代治疗和Ax l基因敲除对血管僵硬度的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组颈动脉和腹主动脉僵硬系数(β)和血管压力-应变弹力模量(Ep)明显增加,动脉扩张系数(DC)和动脉顺应性系数(CC)明显减少。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组β和Ep升高更明显,DC降低更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉β和Ep减小,DC和CC增大。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/-TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉β、Ep、DC口CC变化不明显。4.5 TU替代治疗和Ax l基因敲除对血压的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)和脉压差(PP)明显增加。SBP、DBP、MAP和PP在WT衰老组与Axl-/-衰老组之间没有明显差异。与WT衰老组相比,WTTU替代治疗组PP明显降低,SBP、DBP、MAP变化不明显。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/-TU替代治疗组SBP、DBP、MAP和PP变化不明显。4.6 TU替代治疗和Axl基因敲除对血管纤维化的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组胶原沉积、胶原/弹力纤维比值以及平均主动脉壁结构评分均明显增加,弹力纤维含量降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组胶原／弹力纤维比值升高更明显,胶原沉积、弹力纤维含量以及平均主动脉壁结构评分无明显差异。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组胶原沉积、胶原/弹力纤维比值以及平均主动脉壁结构评分均有所降低,弹力纤维含量有所升高。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/-TU替代治疗组胶原沉积、弹力纤维含量、胶原/弹力纤维比值以及平均主动脉壁结构评分无明显差异。与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组胶原Ⅰ/Ⅲ表达明显增加。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组胶原Ⅰ/Ⅲ表达升高更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组胶原Ⅰ/Ⅲ表达有所降低。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组胶原Ⅰ/Ⅲ表达无明显差异。4.7睾酮替代治疗和Ax l基因敲除对MMP2/9表达和活性的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组MMP-2和MMP-9表达和活性以及MT1-MMP表达、MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值明显增加,TIMP-1和TIMP-2表达降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组MMP-9表达和活性以及MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值升高更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组MMP-2和MMP-9表达和活性以及MT1-MMP表达、MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值有所降低,TIMP-1和TIMP-2表达有所升高。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组MMP-2和MMP-9表达和活性、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2表达、以及MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值无明显差异。4.8睾酮替代治疗和Axl基因敲除对Akt/Fxo01a磷酸化水平的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组Akt和FoxO1a磷酸化水平明显降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组Akt和FoxO1a磷酸化水平降低更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代组Akt和FoxO1a磷酸化水平有所升高。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组Akt和FoxO1a磷酸化水平无明显差异。5研究结论(1)TU替代治疗可以改善血管衰老和血管重构；(2)延缓细胞衰老可能是TU改善血管衰老和血管重构的重要机制；(3)Axl在TU延缓血管衰老过程中发挥关键作用。