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人乳头瘤病毒(human papilloma virus HPV)的感染是引发宫颈癌的主要原因。HPV的E6和E7基因的整合和持续表达是HPV致癌的主要环节,也是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。90%以上的宫颈癌细胞中都可检测到HPV-DNA的存在,其中大部分为HPV16型和18型。由于宫颈癌细胞中整合的E6和E7基因与人体自身基因无同源性,可以成为理想的生物治疗靶标。因此,阻断细胞内整合型E6的表达不仅有利于进一步阐明宫颈癌的发病机制,而且在宫颈癌的生物治疗方面有潜在的应用前景。目前阻断细胞内整合型E6的表达主要使用反义核酸和靶向性核酶技术,但这两种方法的抑制效率不高,而且不能体内使用。近年来RNA干扰技术的兴起为此带来了新的契机。RNA干扰技术是通过双链RNA来阻断目的基因的表达,使用经细胞内转录后形成的发夹状短链干扰RNA(small hairpin RNA,shRNA),抑制靶基因的持续时间可达7天以上。慢病毒的感染效率高、激发免疫反应的作用弱,是携带干扰RNA理想载体。目前以慢病毒为载体的shRNA抑制宫颈癌细胞中E6的表达尚未见文献报道,因此我们设计了三条靶向HPV16E6的shRNA表达序列,将其克隆到慢病毒工作质粒PLL3.7中并经酶切和测序鉴定。PLL3.7与三种混合包装质粒以lipofectamine2000包裹后转染293FT细胞,由此产生shRNA重组慢病毒。以慢病毒感染宫颈癌Caski细胞后,检测癌细胞中HPV16E6表达的变化,与E6致癌相关基因P21和P53表达的变化;观察细胞增殖能力和侵袭能力的变化。研究结果如下。1.293FT细胞包装出的慢病毒滴度为5×106TU/ml。2.慢病毒感染后,Caski细胞中HPV16E6mRNA的含量下降80%,E6蛋白的表达下降65%;同时细胞中P53和P21蛋白表达水平明显上升,约为对照组的2.5倍。3. shRNA作用于Caski细胞7天后,细胞增殖能力下降:实验组仅为对照组细胞数的45%;细胞侵袭力也下降:实验组穿膜细胞比对照组减少65%。由于受包装系统效率的限制,一般逆转录病毒原液的滴度只有105TU/ml。本实验发现:慢病毒原液的滴度在106TU/ml以上;无义慢病毒感染前后Caski细胞的形态和增殖能力无明显变化。结果提示:增加慢病毒用量对宫颈癌Caski细胞无明显毒性,却能显著提高靶细胞的感染率。慢病毒原液滴度高,具有良好的实用性,是将目标基因导入宫颈癌细胞较理想的载体。HPV E6蛋白结合P53并通过泛素途径使其降解是细胞恶性转化的关键步骤之一。处于稳定期的细胞DNA受到损伤时,P53数量的增加使细胞停止于G1期,使损伤的DNA在复制之前得以修复。P53能激活WAF基因,WAF基因产物P21可与Cdk家族的激酶结合并抑制其活性,使细胞周期停止。P53失活后对细胞增殖周期相关因子P21、PCNA、Cyclins、Cdks的调节作用丧失,细胞中DNA损伤积累造成细胞癌变。我们的研究表明:慢病毒感染Caski细胞后,能将shRNA表达序列整合到细胞基因组中,转录形成的shRNA能阻断HPV16E6的表达,蛋白抑制率在65%以上;在HPV16E6表达下降后,其对P53的抑制作用被解除,细胞中P53蛋白的含量升高,P21蛋白的表达也升高。结果提示:我们构建的shRNA重组慢病毒能高效地抑制癌细胞内HPV16E6的表达,这为深入研究E6致癌的下游信号转导提供了良好的工具。HPV E6蛋白的持续表达是宫颈癌细胞维持恶性表型的关键因素之一。本课题研究发现:抑制E6蛋白的表达后,宫颈癌Caski细胞的增殖能力下降,细胞的倍增时延长;穿透transwell膜的细胞数目减少,这代表细胞的侵袭能力下降,提示阻断细胞中E6的表达可明显降低癌细胞的恶性表型;慢病毒介导的shRNA在宫颈癌生物治疗方面具有潜在的应用价值。综上所述,本课题成功构建了能高效抑制细胞中整合型E6表达的shRNA重组慢病毒,为进一步研究E6致癌的下游机制打下了良好的基础。慢病毒整合到细胞后,其持续产生的shRNA能有效抑制宫颈癌细胞的增殖能力和侵袭能力,具有潜在的应用前景。