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肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae,K.Pneumoniae),是一种可引起多种动物患病的条件性致病菌,也是常见的人兽共患病病原。本研究对貂源肺炎克雷伯氏菌血清型和毒力基因进行了检测并对其致病性进行了研究;其对水貂克雷伯氏菌的防控具有重要的实践意义,更具有重要的公共卫生学意义。1.血清型的检测采用克雷伯氏菌血清型检测PCR方法对本实验室分离保存的23株水貂肺炎克雷伯氏菌进行了常见血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)的检测。并对其中15株菌(K.pneumoniae-SD-1~K.pneumoniae-SD-13,K.pneumoniae-SD-15和K.pneumoniae-SD-21)的阳性血清型进行了克隆测序分析,且于GenBank中收录的肺炎克雷伯氏菌菌株作为参考菌株进行比较,制作了系统发生树和同源性的分析。其结果除了K.pneumoniae-SD-15不是上面血清型中的任何一个血清型之外,其他22株都是K2血清型;15株代表菌株中的14株阳性血清型K2基因与参考菌株23(分离于人的器官)、wzy-K2(分离于人的痰液)都在一个分支上,亲缘关系很近;与参考菌株23、HK787、ATCC43816和VGH52523的同源性为99.7%-100%。表明山东地区以K2血清型为主的强毒株肺炎克雷伯氏菌能感染水貂并且在水貂上流行。2.毒力基因的检测采用PCR方法对主要毒力基因rmpA、菌素、iroNB、iucB、wcaG、uge、magA、wabG、all S、ureA、fim和ybtA进行检测,结果显示ureA基因的检出率100%(23/23);菌素、rmpA、uge和wabG的检出率均为96%(22/23);毒力基因Iuc B检出率87%(20/23)、毒力基因ybt的检出率为13%(3/23),其他毒力基因fim、wcaG、allS、magA和iroNB均未检出,其中有16株菌株均有ureA、IucB、rmpA、菌素、uge和wab 6种主要毒力基因,1株菌株均有ureA、IucB、rmpA、菌素、uge、wab和ybtA 7种毒力基因。这表明同一菌株有好几种不同的毒力基因。并对其中15株菌(K.pneumoniae-SD-1~K.pneumoniae-SD-13,K.pneumoniae-SD-15和K.pneumoniae-SD-21)的阳性毒力基因进行了克隆测序分析,且于GenBank中收录的肺炎克雷伯氏菌菌株作为参考菌株进行比较,制作了系统发生树和同源性的分析。系统发生树结果显示:15株代表菌株中的14株阳性rmpA基因与参考菌株TMV-5(分离于人的器官)的血缘关系很近;15株代表菌株中的14株阳性菌素基因与参考菌株cg43(分离于人的血液)、ed23(分离于人的血液)都在一个分支上;15株代表菌株的阳性wabg基因与参考菌株cg43(分离于人的血液)、ntuh-k2044(分离于人的肝脏和血液)都在一个分支上;15株代表菌株中的12株阳性iucb基因与参考菌株rjf999(分离于人的血液)、t69(分离于人的痰液)亲缘关系很近;15株代表菌株中的2株阳性ybta基因与参考菌株ntuh-k2044(分离于人的肝脏和血液)亲缘关系很近。同源性分析结果显示:15株代表菌株中的14株阳性rmpa基因与参考菌株ntuh-k2044、kctc2242、ed23和rjf293的同源性为99.1%-100%;15株代表菌株中的14株阳性菌素基因与参考菌株atcc43816、cg43和ed23的同源性为98.2%-100%;15株代表菌株的阳性wabg基因与参考菌株ntuh-k2044、kctc2242、ed23、cav1217和cav1042的同源性为98.4%-100%;15株代表菌株的阳性urea基因与参考菌株cg43、rjf293、cav1042和u41的同源性为98.2%-100%;15株代表菌株中的14株阳性uge基因与参考菌株kctc2242、rjf293、cav1453和kp52.145的同源性为97.8%-100%;15株代表菌株中的12株阳性iucb基因与参考菌株rjf293和sb227的同源性为94.6-99.7%;15株代表菌株中的2株代表菌株的ybta基因与参考菌株ntuh-k2044、kp36、11和ed23的同源性99.3-99.7%。结果表明貂源肺炎克雷伯氏菌与人源肺炎克雷伯氏菌的亲缘关系很近。3.致病性研究本研究根据分离菌株所携带的血清型、毒力基因的不同选择3株菌株,建立貂源肺炎克雷伯氏菌对小鼠和水貂的致病性研究。分别给小鼠和水貂攻毒后,结果显示,在2—8天均表现精神沉郁、食欲减退,结膜苍白,呼吸浅速,站立不稳且抽搐,被毛逆乱,体温升高,偶尔咳嗽,鼻腔内有分泌物,第4—7天死亡达到高峰,剖检死亡小鼠和水貂发现腹腔内均有明显的黏液,且易拉丝,肝有坏死灶、发硬、发黑;肺肿大出血;病理组织学观察,肺、肝,脑都有不同程度的出血,充血现象。ld50结果显示,k.pneumoniae-sd-12和k.pneumoniae-sd-21菌株对小鼠的ld50分别为5.0×102cfu和3.2×100cfu;对水貂的ld50分别为1.6×103cfu和3.2×101cfu;然而k.pneumoniae-sd-15对小鼠和水貂都没有致病性。由上述血清型和毒力基因检测可知,k.pneumoniae-sd-12和k.pneumoniae-sd-21菌株均有荚膜血清型k2、菌素和rmpa毒力基因,而k.pneumoniae-sd-15不是血清型k2,且没有菌素和rmpa毒力基因。本研究的结果证实,貂源肺炎克雷伯氏菌含有荚膜血清型k2、菌素和rmpa毒力基因的菌株具有较高的致病性。