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术后感染及无菌性松动是导致种植治疗失败的常见因素。种植体骨结合初期受到免疫细胞及成骨相关细胞的调控,并历经包括炎症反应、组织愈合等一系列生物学过程。当前研究大多聚焦于种植体对成骨相关细胞的直接作用而忽略了骨免疫相关细胞在骨结合过程中的级联调控效应。因此,本项目拟以种植体植入后愈合初期的生物级联调控过程为切入点,基于碱热处理后表面的质子化效应及聚多巴胺修饰后的二齿螯合作用,将具有促进成骨作用的Sr2+及具有抗菌效果的Ag NPs引入三维打印的仿骨小梁多孔种植体表面,创新性地构建具有抗菌和促成骨功效的双离子(Sr和Ag)独立缓释种植体系。经体内外实验验证该体系对负载元素的独立缓释效果,明确上述离子局部缓释对种植体周骨免疫细胞的调控作用及对下游骨生成相关细胞的间接影响,进而阐明其作用的级联分子信号机制,为处于复杂病理环境下缺牙患者种植治疗的成功提供新思路及新选择。第一部分AH-Sr-Ag NPs的构建与理化性能表征目的:构建一种基于碱热处理后表面质子化效应及聚多巴胺修饰后二齿螯合作用的、具有抗菌和促成骨功效的双离子(Sr2+和Ag+)独立缓释种植体系。方法:(1)利用选择性激光熔融金属三维打印技术设计并制备仿骨小梁的多孔钛种植体;(2)利用碱热处理在多孔钛种植体表面形成微-纳分级结构的纳米针样结构,继而利用该分级结构上大量活跃的羟基的质子泵效应经水热沉积将Sr2+稳定负载于种植体表面(AH-Sr);(3)在AH-Sr表面进行聚多巴胺自聚合,通过二齿螯合及氧化还原特性将硝酸银以纳米颗粒形式还原于AH-Sr,最终形成具有抗菌、促成骨双重作用的多功能种植体(AH-Sr-Ag NPs);(4)采用万能力学测试机进行压缩试验,分别测定多孔钛种植体的力学性能,以及新西兰兔皮质骨和松质骨的力学性能;(5)扫描电镜(SEM)和透射电镜(AFM)观测钛表面涂层的形态及粗糙度;(6)能谱仪(EDS)和X射线光电子能谱仪(XPS)检测钛表面涂层的元素组成及分布;(7)采用固定液滴法测定材料表面接触角(CA);(8)采用BCA微蛋白分析试剂盒检测材料表面对纤连蛋白(FN)的吸附能力;(9)采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定分析Sr2+和Ag+释放。结果:(1)成功制备种植体表面涂层AH-Sr-Ag NPs。(2)压缩测试实验结果显示AH-Sr-Ag NPs涂层具有比纯钛更低的弹性模量,其弹性模量为4.88±0.25 GPa与松质骨的弹性模量相似(4.76±0.33 GPa)。(3)在高倍率扫描电镜下,可以观察到AH-Sr-Ag NPs涂层表面形成均匀的纳米纤维网状结构,并且在其表面上可以清楚地看到银纳米颗粒(φ=42.2±0.33 nm)。(4)原子力显微镜结果显示,对照组样品Ra为24.028±0.01 nm,而AH-Sr-Ag NPs样品表面则明显较粗糙(Ra=69.594±0.03 nm)。(5)水接触角结果显示光滑纯钛表面的CA为61.95±3.02°,而亲水性的AH-Sr-Ag NPs其表面CA为11.25±2.32°。(6)蛋白吸附实验显示AH-Sr-Ag NPs涂层能够吸附明显更多的纤连蛋白。(7)释放实验结果显示Sr2+释放在前4天内释放量相对较高(每天>0.05 ppm)。在接下来的3周内,Sr2+的释放量减少。缓慢逐步释放Ag+更有利于长期预防细菌感染。与Sr2+相比,Ag+没有出现明显的暴释,Ag+的每日释放量保持在0.06μg m L-1。结论:(1)成功构建具有抗菌和促成骨功效的双离子(Sr2+和Ag+)独立缓释种植体系。(2)AH-Sr-Ag NPs涂层表面的粗糙度增加,亲水性更强且蛋白吸附能力更高。(3)AH-Sr-Ag NPs涂层实现了在离子治疗窗范围内Sr2+和Ag+的缓释第二部分AH-Sr-Ag NPs的抗菌性能评价目的:比较光滑纯钛表面和AH-Sr-Ag NPs涂层表面抗菌性能的差异,明确AH-Sr-Ag NPs种植体系的抗菌性。方法:(1)革兰氏阴性菌株Escherichia coli(E.coli,ATCC 8099)和革兰氏阳性菌株Staphylococcus aureus(S.aureus,ATCC 25923)的传代及培养;(2)通过在AH-Sr-Ag NPs涂层表面培养E.coli或S.aureus,对不同钛表面进行细菌形态学观察和抗菌效能的相关检测。结果:(1)AH-Sr-Ag NPs涂层表面E.coli和S.aureus的数量均显著减少,并且光滑纯钛表面上存在形状不规则且菌毛明显的细菌。(2)光滑纯钛表面上E.coli和S.aureus的细菌数分别为258.4±26.03 CFU和460.8±13.49 CFU;而在AH-Sr-Ag NPs表面则几乎没有细菌生长。(3)AH-Sr-Ag NPs涂层对E.coli和S.aureus的抗菌效率分别达到98.66±4.24%和98.17±2.31%。结论:(1)AH-Sr-Ag NPs涂层具有良好的抗菌性,能有效抑制种植体表面细菌的生长。第三部分AH-Sr-Ag NPs对骨免疫细胞及下游成骨相关细胞的生物级联调控作用目的:明确AH-Sr-Ag NPs缓释种植体系局部释放的Sr2+和Ag+对骨免疫细胞及下游成骨相关细胞表型的影响及关键调控环节,为提高种植治疗的成功率提供新的材料选择及表面改性策略。方法:(1)巨噬细胞株(Raw264.7)和成骨前体细胞株(MC3T3-E1)的传代及培养;(2)Raw264.7在AH-Sr-Ag NPs涂层表面进行培养,探究AH-Sr-Ag NPs涂层对Raw264.7细胞极化的调控作用及对细胞形态的影响;(3)Raw264.7与MC3T3-E1在AH-Sr-Ag NPs涂层表面进行间接共培养,探究AH-Sr-Ag NPs涂层对Raw264.7细胞极化的调节及对下游成骨相关细胞粘附、伸展及分化的影响;(4)在基因和蛋白表达水平探索AH-Sr-Ag NPs涂层对上述细胞行为的具体调控机制及关键调控环节。结果:(1)M1型巨噬细胞表面标志物CD86的m RNA表达在光滑纯钛表面和AH-Sr-Ag NPs涂层之间无显著差异。M2型巨噬细胞表面标志物CD206的m RNA表达在AH-Sr-Ag NPs表面上显著升高。(2)M1型巨噬细胞表面标志物i NOS的蛋白表达在AH-Sr-Ag NPs表面上显著降低。(3)培养24h后,光滑纯钛表面上巨噬细胞形态呈鸡蛋样状;而AH-Sr-Ag NPs表面上细胞伸展良好呈纺锤状。(4)间接共培养后,AH-Sr-Ag NPs表面上MC3T3-E1的细胞周长和细胞面积等参数明显高于光滑纯钛表面上的细胞。(5)间接共培养后,AH-Sr-Ag NPs表面上MC3T3-E1中成骨相关基因的表达如ALP、Runx2和Col-1较对照组均明显增加。结论:(1)AH-Sr-Ag NPs涂层表面能够调控巨噬细胞的极化状态,增加M2型巨噬细胞的数目。(2)AH-Sr-Ag NPs涂层表面能够通过调控巨噬细胞的极化状态进一步调控下游成骨前体细胞的粘附、伸展以及分化能力。第四部分AH-Sr-Ag NPs在细菌污染受植床发生骨整合及骨缺损修复的在体研究目的:通过AH-Sr-Ag NPs双离子缓释种植体系的体内植入模型,明确其在有菌受植床条件下的抗菌及促进骨生成作用。方法:(1)建立新西兰大白兔双侧股骨头远心端细菌污染受植床种植体植入的动物模型;(2)通过micro CT、VG染色及组织形态计量学评估局部缓释的Sr2+和Ag+对兔股骨远心端细菌污染受植床的抗菌及促进愈合效能。(3)通过分子生物学手段如巨噬细胞功能抑制剂AP20187,尝试探索该种植体系发挥作用的内在机制。结果:(1)VG染色结果显示,AH-Sr-Ag NPs组中新骨形成明显较对照组更好;而与AH-Sr-Ag NPs组相比,AH-Sr-Ag NPs+AP20187组中种植体周围新骨形成较少。(2)与对照组的骨-植入物接触率(BIC%=25%)相比,AH-Sr-Ag NPs植入物表面的BIC%超过75%,而AP20187应用组的BIC%则低于60%(3)与AH-Sr-Ag NPs组相比,在感兴趣区域(ROI)中AP20187应用组的骨形成率(BF%)相对较低。(4)通过连续荧光示踪技术分析不同组的骨形成情况。与对照组相比,AH-Sr-Ag NPs组种植体在整个实验时间段内诱导骨形成的速度更快。(5)Micro-CT结果显示AH-Sr-Ag NPs组种植体周围基本全部被新生骨组织覆盖并长入植体的孔隙中,而AP20187应用组中植体周围的骨组织覆盖和骨长入则受限。结论:(1)通过建立体内细菌污染受植床的植入模型,AH-Sr-Ag NPs种植体系促进成骨的能力得到验证。(2)通过设置包含免疫细胞抑制剂的植入组,进一步说明AH-Sr-Ag NPs种植体系在一定程度上通过调节巨噬细胞的状态进而影响种植体周围的骨再生。