金属有机框架仿生矿化体系提高蛋白质稳定性的研究

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生物矿化是生物体自身生成无机矿物的过程,诸如牙齿、骨骼等的形成。仿生矿化是一种模拟生物体矿石成分形成的过程。方钠石型甲基咪唑锌(ZIF-8)作为一种简单的金属有机框架材料,凭借其优良的物理化学性质,在多种领域显示出应用潜力。本文利用仿生矿化手段在蛋白质表面引入了 ZIF-8材料,研究ZIF-8材料对蛋白质分子稳定性的提升效果,明确蛋白质特性与ZIF-8材料保护效力之间的相关性,为仿生矿化技术提高蛋白质稳定性研究提供新思路。本文首先以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,通过调整反应体系的蛋白质浓度与配体/金属离子比例,优化以ZIF-8为保护材料包封BSA的仿生矿化体系,确定最优蛋白浓度为1.0 mg/mL,2-甲基咪唑/锌离子(HmIm/Zn2+)比例为16,实现了 BSA@ZIF-8体系的制备。运用扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和X射线衍射仪技术(XRD)对优化后体系进行结构与形貌的表征,结果表明包含BSA的BSA@ZIF-8体系与空白ZIF-8基本一致。BSA@ZIF-8在pH 4.0的酸性环境下能够实现BSA的快速释放,该释放过程30 min可以完成。与此同时,研究发现BSA的引入能够在不改变ZIF-8晶型结构的情况下加速ZIF-8结晶过程,所得产物中存在约28 wt%的结构水。最后对BSA@ZIF-8体系进行70℃条件下的蛋白稳定性测试,处理1h后比游离BSA的表面疏水性变化减少40.5%。研究将ZIF-8用于葡萄糖氧化酶(GOx)、中性蛋白酶(Dispase)、脂肪酶(Lipase)、辣根过氧化物酶(HRP)、脲酶(Urease)等五种酶蛋白的稳定性研究,以剩余酶活为定量分析指标探究ZIF-8仿生矿化体系在不同结构蛋白质中的应用特性。在1.0 mg/mL的蛋白质浓度和HmIm/Zn2+比例为16的条件下制备相应产物,所得的复合物经红外和热重分析,确定目标蛋白质被ZIF-8包埋,且ZIF-8仍旧保持完整晶型结构。通过设计不同的加热时间与pH条件测定ZIF-8矿化体系对目标蛋白质热稳定性与pH耐受性的提升效果,获得ZIF-8对酶最适温度的影响。经过15 min的热处理,释放后的Dispase@ZIF-8剩余活性比游离Dispase提升了 31.9%。此外,研究对ZIF-8提升蛋白热稳定性进行深入分析,结果显示蛋白质表面的组氨酸残基占比与体系稳定性、包封后活性以及包封率具有较强相关性:蛋白质稳定性随组氨酸残基占比的增加先升高后降低,极值点出现在1.8%附近,蛋白质包封后活性随组氨酸残基占比的增加而降低,蛋白质包封率随组氨酸残基占比的增加而升高。本文进一步选取表面组氨酸残基占比为2.4%和8.6%的人血清白蛋白(HSA)和牛血红蛋白(Hb)进行实验。通过对SEM和FTIR结果分析,确定前述包封体系可以用于提高HSA和Hb稳定性的应用。在70℃条件下处理1 h后,Hb@ZIF-8体系的疏水性变化比游离Hb减小17.8%,HSA@ZIF-8体系的疏水性较游离HSA减小5.5%。在室温下储存21天后,Hb@ZIF-8疏水性变化较游离Hb减小12.6%,HSA@ZIF-8体系的疏水性变化较游离HSA减小9.3%。本论文研究ZIF-8矿化体系在不同目标蛋白上的应用效果,发现并验证了ZIF-8矿化体系的保护效果与目标蛋白表面残基的组成具有相关性,为ZIF-8矿化体系在蛋白稳定性方面的应用提供了新思路。
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