脑是人体最精密的器官之一，在长期的进化过程中形成了独特有效的保护机制。它可将有毒、无效等许多物质隔离在脑组织外，但同时也使许多药物难以进入脑内发挥治疗作用。如亲水性、大分子及极性强（如多肽类物质、神经生长因子、多数抗生素等）的药物很难透过血脑屏障（brain-blood barrier，BBB），而亲脂性、极性小的药物虽然能透过BBB，但是BBB内特殊的酶系统不仅能将透过的大多数药物迅速代谢失活，且其高特异性的外排机制如P-糖蛋白（P-glycoprotein）、MOAT（multiple organic anionic transporter）、mdr（multi-drug resistance protein）等能将许多透过BBB的脂溶性物质外排至血液中，使得药物相应的药理效应降低。因此要治疗脑部疾病，首先需解决药物能有效进入脑内并保持应有的治疗浓度；而穿过BBB是保证药物发挥治疗作用的前提。BBB是由脑毛细血管内皮细胞通过致密连结而成。与其他组织的毛细血管内皮组织比较，其致密度高出100倍；且缺乏允许物质自由交换所需的间隙或通道。其独特的结构使得许多药物很难从外周血液循环系统通过BBB进入脑内。因此BBB几乎是向脑组织传输药物的一道难以逾越的屏障。目前促使药物穿过BBB进入脑组织内的主要手段有：1)颈动脉注射高渗溶液使BBB的通透性增加而将药物传输至脑组织内；2)化学修饰改变药物的极性---如制成前药使药物的亲脂性增强等；3)将药物与BBB上的某些受体偶联促使药物进入大脑等。4)直接向脑内注射药物或是向脑组织中植入含有药物的高分子载体材料；但是这些手段均存在不足，如：1)容易使那些不需要的物质同时进入脑内，选择性不强；2)药物亲脂性增强后，易改变药物的组织分布及半衰期等参数，同时能修饰的药物也有限；3)药物须具有载体特异性，限制了药物的理化特性；4)有些是创伤性的，须对患者施行外科手术才能完成，患者不易接受；也有报道通过制备表面偶联有抗体的脂质体来增加药物的透过量，但迄今为止其结果仍不能使人信服。当前新型的药物传输系统（Drug Delivery System，DDS），尤其是利用无毒的高分子材料为载体制备的纳米制剂，作为透过BBB的手段近二十年来已引起极大关注。纳米粒是纳米尺寸的胶态固体颗粒，它可通过包裹、吸附及化学链接的方式携带药物。具备许多常规制剂所没有的优势：能增强药物的治疗作用、减少给药量和降低药物的毒副作用，将药物包裹于基质中能有效提高药物的稳定性，具有一定的靶向和控缓释等特点。但普通纳米制剂静注后，血浆中的多种成分（如载脂蛋白、补体C蛋白等）会吸附于纳米粒的表面，使其易于被吞噬细胞识别，即机体的调理过程（opsonization），被单核巨噬细胞吞噬系统（mononuclear phagocyte system，MPS）吞噬并迅速从血液中清除。因而如何避免MPS对纳米粒的识别和吞噬是其能否被传输至其它器官或组织的关键。研究发现纳米粒的表面特性如亲脂性强弱、表面电位值等与调理素蛋白在其表面的吸附息息相关。一般来说纳米粒的表面亲脂性越强、表面电位值越低，调理素蛋白越容易吸附。由此可见纳米粒的表面特性对制备长循环纳米粒极为重要。目前针对纳米粒表面改性的研究主要集中在两个方面：1)在纳米粒的表面包被亲水性的聚合物或表面活性剂；2)制备含亲水性片断的两亲性高分子载体材料，这些材料含有PEG、PEO、poloxamer、poloxamine、Polysorbate-80及Briji-35等。其共同点是能在纳米粒亲脂性内核的表面形成水化保护层（protective clouds）并具备一定的立体位阻效应，能抑制调理素蛋白在纳米粒表面的吸附，即所制备的纳米粒具有‘隐形’（stealths）特性，从而使得纳米粒不易被MPS识别，达到长循环目的。但是利用上述材料制备的长循环纳米粒并不都能增加透过BBB的药物量，如应用poloxamine 908包被纳米粒后，所制备的纳米粒在体内循环的时间虽然显著延长，而进入脑组织内的药物量与对照组比较并无显著性差异；利用PEG作为亲水性的高分子片段合成的两亲性的高分子材料为载体制备的纳米粒，纳米粒表面吸附的调理素蛋白的量及种类与PEG链的长度、共聚物中PEG的含量及纳米粒被覆的PEG水化层的厚度有关。随着对纳米粒表面改性研究的进一步深入，制备能透过BBB的纳米制剂近年来已取得长足的进步。如不能透过BBB的多肽类物质dalargin，将其制成PBCA纳米粒后，再经Tween-80或载脂蛋白B、E包被后便能穿过BBB并产生相应的药理效果，且其药理活性和进入脑内的药物量与对照组比较均有显著性差异，其它的还有loperamide、doxorubicin及神经生长因子等药物，通过这种方式均能有效地透过BBB；另一方面是应用PEG-PLGA、PEG-PLA及PEG-PHDCA等材料制备的core-shell型纳米粒，其外层由亲水性的高分子长链组成，它能有效避免调理素蛋白对纳米粒的吸附；内核为亲脂性的高分子片段可作为亲脂性药物的储库。包被有Tween-80等表面活性剂的纳米粒虽能进入脑部，但是在体内微环境中，有学者认为血液中物质和包衣层物质间范德华力的存在容易引起包被层在体内循环中脱落，脱落的外源性物质作为一种外来性抗原对人体可能产生的潜在毒副作用值得关注，同时对被覆有Tween-80的纳米粒的毒性评价仍存在争议，临床应用也极为不便；在两亲性高分子载体合成方面，目前文献报道的共聚物几乎均为AB型或者ABA型，其中包含有亲水性的片段如PEG、PEO等，具体的载体材料有PEG-PLGA、PEG-PLA及PEG-PHDCA等。其制备多是将PEG或单甲基取代的PEG分子、PEO等与乳酸分子单体或氰基烷酸酯等单体聚合反应而成，其反应条件要求苛刻如要求惰性气体保护、反应管需融封、添加引发剂等。本课题直接选用适宜分子量的PEG和PCL为原料，琥珀酸酐为桥联剂，制备含不同重复单元数量的PEG和PCL的共聚物。PCL为半结晶状的高分子材料，选用它作为两亲性共聚物载体的亲脂性部分，既可以作为亲脂性药物的储库，其所含有的晶状结构成份又有利于保持纳米粒形态的稳定。PCL应用历史悠久，如将其作为长效避孕药体内埋植剂的载体材料、组织工程材料等；PEG安全无毒，已被FDA批准应用于临床。本课题所选用的制备方法具有反应条件温和、简便易行和反应收率高等优点。选用治疗脑中风等疾病疗效确切的中药活性成分银杏内酯B（Ginkgolides B）作为脑靶向制剂的模型药物。银杏内酯是一类由银杏中分离出的天然产物，包括银杏内酯A、B、C、J、K等。它是一类强特异性的血小板活化因子（platelet activating factoG PAF）拮抗剂，其中尤以GB的活性最强。银杏内酯要发挥其脑部治疗作用，首先要保证有足够的药物能透过BBB进入脑组织。但是GB的几乎不溶于水，溶解度仅为2.5×10^-4M，且研究表明，进入体循环后，GB的内酯环易水解、开环，并迅速分布到胃、十二指肠、肝等部位，注射给药后30分钟，脑内很多部位已很难检出药物。两亲性的PEG-PCL多嵌段共聚物为载体材料，其中亲脂性的PCL片段可充当GB的储库，既能有效地解决GB溶解度低的问题，又可以避免GB在血循环中的被快速水解，使得以原药形式有效透过BBB药量增多成为可能，同时所制备的制剂兼有缓释作用。材料与方法1 GB-PBCA-NPs的制备及表征采用表面聚合法，葡聚糖-70为表面活性剂，搅拌条件下制备GB-PBCA-NPs，并考察不同的PH值、搅拌速度、表面活性剂浓度及反应温度对制备的影响。用malvern激光粒度仪测定NPs的表面电位、粒径及粒径分布；电镜观察NPs的形态；用LC／MS／MS检测NPs的载药量和包封率，并探讨了不同低温保护剂对冻干NPs的影响。选用昆明小鼠考察所制备NPs的急性毒性。2 GB-PEG-PCL-NPs的研究选用适宜分子量的PEG和PCL为起始原料，琥珀酸酐为桥联剂，合成多嵌段的两亲性共聚物载体，并用¹HNMR、FT-IR、XRD等对共聚物进行表征；选用L929细胞株，以MTT和乳酸脱氢酶（LDH）活性指标考察所合成共聚物的生物相容性；采用溶剂挥发法制备以共聚物为载体的GB-NPs，所制备的NPs的表征同上。3 GB-NPs的体外释药试验采用动态透析法，以PH 7.4的磷酸盐缓冲液为释放介质，37℃条件下，100rpm进行体外释药试验。在设定的时间点上取样测定其中的GB含量，计算累计释药量；采用不同的数学模型对不同纳米制剂的体外释药曲线进行拟合，探讨其可能的释药机制。4 GB-NPs在小鼠体内的组织分布研究共设定GB溶液组，包被1％Tween-80的GB-PBCA-NPs及4种两亲性共聚物载体制备的GB-NPs共6组；以昆明小鼠为实验动物，给药剂量为1mg／kg，经尾静脉注射给药并在设定的时间点上取血及不同脏器进行GB含量测定；考察GB组织分布并用靶向指数对不同NPs的脑靶向作用进行评价。5 GB-NPs的药效学研究采用改良线拴法制备大鼠大脑中动脉梗塞模型，随机分组，于缺血2h后实施再灌注，经尾静脉给予不同的制剂，给药剂量为3mg／kg。再灌注24h后，考察动物行为评分、脑组织含水量、脑梗死面积及各组脑组织病理变化等指标。结果1 GB-PBCA-NPs的制备及表征结果表明，不同的反应PH值、不同的搅拌速率和有机相体积、反应温度对GB-PBCA-NPs的粒径及分布有影响，而表面活性剂Dextran-70的浓度对其影响不大；设定的处方条件为：0.5％Dextran-70，800rpm，丙酮20ml，室温、PH值中性条件下制备纳米粒。所制备GB-PBCA-NPs的粒径为110.4nm，表面电位为-29.3mv，多分散系数为0.094，电镜观察表明所制备的GB-PBCA-NPs为分布均一的球形颗粒；其相应的载药量和包封率分别为5.74％和96.74％；冻干实验结果表明：添加2.5％的海藻糖为冻干保护剂，所制备的冻干纳米制剂外观为白色，冻干前后体积不变、无裂缝、脱壁等现象；有较好的复水性，复水后的纳米粒径为138.5nm，多分散系数为0.11；急性毒性实验结果表明给予小鼠90mg／kg剂量的GB-PBCA-NPs，相当于人临床应用剂量9.9mg／kg未见有毒性及其它不良反应。2 GB-PEG-PCL-NPs的研究所制备的两亲性载体经HNMR、FT-IR、XRD等证实为所需物质。细胞毒性实验表明所合成的载体基本无毒，具有较好的生物相容性。用共聚物载体制备的GB-NPs的粒径为200nm左右，电镜显示其外观为圆形且均一性好。不同的载体制备的GB-NPs均有着高的包封率，但其对应的载药量不同；以共聚物PEG₄₀₀₀-PCL₂₀₀₀、PEG₄₀₀₀-PCL₁₂₅₀、PEG₂₀₀₀-PCL₂₀₀₀及PEG₂₀₀₀-PCL₁₂₅₀为载体制备的GB-NPs对应的载药量分别为7.13％、7.07％、6.53％和6.09％，包封率分别为96.2％、95.4％、94.7％和94.1％。共聚物的表面电位值说明随着共聚物中PEG链段的增长而升高，随着亲脂性组分PCL链段的增长而降低。3 GB-NPs的体外释药试验GB-NPs的体外释药实验表明，所有的纳米制剂的释药规律符合Weibull分布，释药机制可能是被动扩散和纳米粒的溶蚀共同起作用。其中以PBCA为载体的NPs的释药速率最低，而共聚物为载体制备的GB-NPs中，随着分子中PEG片段的增长，对应的NPs释药速率增高；随着分子中PCL片段的增长，其相应NPs的释药速率降低。同时所制备的NPs均具有一定的缓释特点。4 GB-NPs在小鼠体内的组织分布研究组织分布实验证实，包被Tween-80的GB-PBCA-NPs组、GB-PEG₄₀₀₀-PCL₂₀₀₀-NPs组和PEG₄₀₀₀-PCL₁₂₅₀-NPs组能增加给药后小鼠脑组织内的GB含量，与GB溶液组比较，增加具显著性意义（P＜0.05），显示出这3种制剂均具备一定的脑靶向特性；而给与GB-PBCA-NPs、GB-PEG₂₀₀₀-PCL₂₀₀₀-NPs和GB-PEG₂₀₀₀-PCL₁₂₅₀-NPs，与GB溶液组比较并未能增加小鼠脑组织内的GB含量（P＞0.05）。5 GB-NPs的药效学研究药效学研究表明，各处理组均能有效改善模型大鼠的脑缺血症状，降低急性不完全性脑缺血大鼠的脑含水量及脑毛细血管通透性，改善模型大鼠神经症状，减少其脑梗塞灶体积；与模型组比较，差异均有显著性意义（P＜0.05）。结论本研究所制备的GB-NPs能有效增进GB在制剂中的溶解度，所制备的GB-NPs的有着窄的粒径分布，电镜表明NPs为圆形，均一性好；给予小鼠90mg／kg剂量的GB-PBCA-NPs，未见毒性及其它不良反应；合成的多嵌段PEG-PCL共聚物有着良好的生物相容性，安全无毒；体外释药研究证实制备的GB-NPs均具有一定的缓释特性并符合Weibull模型，其释药机制可能是被动扩散和溶蚀共同作用；动物体内组织分布实验表明包被Tween-80的GB-PBCA-NPs、GB-PEG₄₀₀₀-PCL₂₀₀₀-NPs和PEG₄₀₀₀-PCL₁₂₅₀-NPs均有一定的脑靶向作用；药效学研究证实所制备的GB-NPs能有效改善大脑中动脉梗塞模型大鼠的脑缺血状态，对抗缺血性脑损伤，具有明确的脑保护作用。