【摘 要】
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本研究根据已发表的猪圆环病毒PCV-1和PCV-2的全基因序列,利用DNAstar软件对PCV-1和PCV-2的全基因序列进行同源性比较,应用Oligo6.0软件设计出两对引物,其中一对PCV特异性引物P1
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本研究根据已发表的猪圆环病毒PCV-1和PCV-2的全基因序列,利用DNAstar软件对PCV-1和PCV-2的全基因序列进行同源性比较,应用Oligo6.0软件设计出两对引物,其中一对PCV特异性引物P1和P2,扩增出PCV-1和PCV-2上长938bp的片段;另一对为PCV-2型特异性引物P3和P4,扩增片段长490bp。复合PCR方法可以检测到1ng的病毒核酸样品。 建立了定量检测猪圆环病毒DNA的竞争PCR方法。PCR扩增PCV-2 ORF2上490bp片段P3P4,构建了目标模板。将P3P4片段应用BanⅡ酶切,再进行连接,之后克隆到pMD18-T载体,构建含694bp的c-P3p4 DNA片段的竞争模板,其携带同目标DNA和样本DNA相同的引物结合区。以定量的竞争模板同一系列稀释的竞争模板进行竞争PCR扩增,结果当反应体系中起始模板的量为1.0×10~7copies/ml,循环次数小于或等于30时,原始模板数以指数增长。以获得目标模板浓度和扩增产物的荧光强度(IOD)比值的回归曲线,将该曲线作为标准曲线。根据竞争模板和目标模板产物之间的荧光强度(IOD)差异,引进了校正系数(Lc/Lt)。将反应中的各种参数带回回归方程,获得根据样品量和PCR产物荧光强度计算浓度的公式。初步应用竞争定量PCR方法检测感染细胞内的PCV-2基因组的拷贝数增殖变化情况和临床样品中的PCV-2 DNA含量,这为猪圆环病毒核酸诊断和疫苗研究奠定了基础。
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