幽门螺杆菌﹙Helicobacter pylori,Hp)是一种革兰氏阴性微需氧菌,1983年Marshal和Warren首次从慢性胃炎患者中分离出来,在人群中的感染率约50%以上。幽门螺杆菌与胃炎、胃溃疡和胃癌的发生密切相关,通过诱导宿主的炎症性因子、转录调节因子、细胞凋亡相关因子、信号转导因子等多种基因的表达而致病。1994年世界卫生组织将其归为Ⅰ类致癌原。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是体内重要的炎症性细胞因子之一,其表达增加与幽门螺杆菌感染存在密切关系,并且促进了胃炎的发展。虽然幽门螺杆菌的感染率很高,但多数感染者并无临床症状,因此推测人体对幽门螺杆菌有自然防御能力。近年来的研究表明,在胃粘膜的贲门腺、幽门腺、颈粘液细胞等部位存在α-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α-1,4-N-acetyglucosaminyltransferase,α4GnT)。它是一种糖基转移酶,转移N-乙酰葡糖胺到具有核2分支O-聚糖的β半乳糖残基上形成α-1,4-N-乙酰葡糖胺末端。研究发现,胃腺粘液中末端连接有α-1,4-N-乙酰葡糖胺的O-聚糖粘蛋白具有天然抗菌素的功能。它通过影响幽门螺杆菌的细胞壁成分胆固醇-α-D-吡喃葡糖苷的生物合成来抑制幽门螺杆菌的增殖、游动并使之变形。推测胃腺粘液细胞中的α4GnT通过在胃腺粘液蛋白的O-聚糖上生成α-1,4-N-乙酰葡糖胺,来阻隔幽门螺杆菌侵入深层胃粘膜,从而对胃粘膜具有自然保护作用。因此,我们应用胃癌培养细胞从基因转录水平和蛋白水平探明幽门螺杆菌及TNF-α对α4GnT基因的调控作用。目的:应用表达α4GnT基因的胃癌细胞,从mRNA水平和蛋白水平探讨幽门螺杆菌与细胞因子TNF-α对α4GnT基因表达的诱导作用。方法:1.细胞培养:胃癌细胞株MGC803复苏后,培养于含10%FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中,置于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养,传代后以每毫升3×105个细胞数接种于新的培养瓶,将接种后48h的细胞用于实验。2.细菌培养:幽门螺杆菌标准菌株J99复苏后,接种于哥伦比亚琼脂培养基(含5%羊血、11μg/ml万古霉素、11μg/ml两性霉素B、0.47μg/ml多粘菌素B),置于37℃微需氧条件下培养。3.实验分组:幽门螺杆菌组:将密度1×105-1×106CFU/ml的幽门螺杆菌与MGC803细胞共培养6h,换液后继续培养至48h。TNF-α组:将终浓度10ng/ml的TNF-α加入细胞作用48h。对照组:细胞内加入等量无幽门螺杆菌和TNF-α的培养基,培养48h。4.应用RT-PCR检测各组α4GnT基因的mRNA表达水平,扩增片段进行8%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与内参照物GAPDH比较判断。5. Western Blot检测各组α4GnT蛋白表达水平,近红外双色激光成像系统扫描后,与内参照物GAPDH进行比较、判断结果。6.免疫组织化学染色方法检测各组α4GnT蛋白表达水平,DAB显色后,光镜下观察细胞,每张盖玻片计数5000个细胞,计算阳性率,各处理组与对照组进行比较。7. RT-PCR与Western Blot检测结果应用凝胶-蛋白分析系统进行相对定量分析,以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS17.0统计软件分析,两组间比较用t检验。免疫组化结果以各组细胞阳性率表示,应用SPSS17.0统计软件分析,两组间比较用χ2检验。显著性检验水准为p﹤0.05。结果:1.RT-PCR检测α4GnTmRNA表达结果:幽门螺杆菌作用于人胃癌细胞MGC803后,α4GnT基因mRNA表达量(0.1160±0.011)与对照组(0.1258±0.00531)比较没有明显的差别,统计结果显示无显著性差异,p﹥0.05;TNF-α作用于人胃癌细胞MGC803后,α4GnT基因mRNA表达量(0.474±0.072)与对照组(0.1520±0.001)比较明显增加,p﹤0.05。2.Western Blot检测α4GnT蛋白表达结果:幽门螺杆菌组α4GnT蛋白表达量(0.2200±0.59)与对照组(0.2120±0.3271)比较没有明显的差别,也无统计学意义, p﹥0.05 ; TNF-α组α4GnT蛋白表达量(0.6180±0.0672)与对照组(0.2080±0.0148)比较增加了3倍,统计学上具有显著性,p﹤0.05。3.免疫组化检测α4GnT蛋白表达结果:免疫组化染色后,光镜下观察,幽门螺杆菌组α4GnT阳性细胞数(2.8%)与对照组α4GnT阳性细胞数(3.4%)比较,没有明显的增多,统计学无显著性差异,p﹥0.05;TNF-α组阳性细胞数(20.9%)与对照组α4GnT阳性细胞数(5.4%)比较有明显的增加,两组间的差异有统计学意义,p﹤0.05。结论:1.人胃腺癌细胞MGC803表达α4GnT基因2.幽门螺杆菌与胃癌细胞MGC803共培养,并未影响α4GnT基因的mRNA及蛋白表达水平发生明显的变化。3. TNF-α作用于胃癌细胞MGC803使其α4GnT基因的mRNA及蛋白表达水平升高,表明TNF-α对MGC803细胞α4GnT基因表达具有诱导作用。4. MGC803细胞系可作为探讨α4GnT基因表达诱导因素的细胞系。