牙周病引起的牙周支持组织吸收破坏是成人失牙最主要的原因。因此,实现牙周支持组织的再生是牙周病治疗的重要目标。但是,目前的临床治疗方法,例如引导性组织再生术(guided tissue regeneration, GTR),仍然无法达到完全的牙周支持组织再生。基于此点,越来越多的学者致力于牙周组织工程研究,以期获得更大程度的牙周组织再生。组织工程主要是指将生长因子,细胞和生物降解支架结合并植入组织缺损处,以实现组织的再生。但是组织工程也存在一些缺陷,例如：较难控制干细胞的分化、生长因子在缺损位置难以保留等,而基因治疗可以在某种程度上克服上述缺陷。因此,将基因治疗和组织工程联合应用可能是实现牙周组织再生较有前景的方法。众所周知,牙周组织具有特定的排列方向。但是,目前牙周组织工程所使用的支架的纤维排列是随机无序的,无法模拟天然的牙周组织有序微观结构,不利于牙周组织的有序再生。而组织工程支架的有序定向排列不仅可以引导细胞的生长方向,而且能够促进细胞的增殖和迁移。因此,本实验设计两种有序定向电纺支架：平行支架模拟牙周膜主纤维的斜向平行排列,交叉支架模拟牙槽骨的交叉排列的骨小梁结构。期望这种有序定向支架可以使牙周组织再生细胞按预制形态生长,并能促进牙周再生相关细胞向组织缺损处快速迁移和增殖,促进牙周组织有序再生。组织工程支架作为一种载体,能促进基因转染细胞在体内的定植。目前研究发现：不同生物材料的支架,所介导的基因治疗的效果也不同。而有序定向支架和基因治疗联合应用是否对基因治疗的效果有影响?目前还没有相关研究。因此,本实验将有序定向组织工程支架与基因治疗联合应用于牙周组织再生,一方面研究有序定向支架与基因治疗复合体在牙周组织工程中的应用价值；另一方面研究支架纤维排列方向是否对基因治疗的细胞甚至基因治疗的效果产生影响。基于组织工程的三要素(细胞、细胞因子、支架)和基因治疗的目的基因和细胞,本实验分别设计有序定向支架和培养过表达BMP2的PDLSCs (BMP2/PDLSCs)。观察BMP2/PDLSCs/有序定向支架复合体的成骨能力,同时观察有序定向支架对基因治疗效果的影响。实验一有序定向电纺支架的设计及性能测定实验目的：设计模拟牙周组织微观结构的有序定向电纺支架,并对其表面特性进行鉴定。实验材料和方法：为了模拟天然牙周膜的有序微观结构,本实验设计两组有序定向支架作为实验组(平行支架：表面纤维呈高度一致性排列：交叉支架：纤维呈两个方向交叉排列)和两组非定向支架作为对照组(随机支架：纤维呈无序随机排列；光滑膜支架：无纤维结构,表面光滑)。同时四种支架除纤维排列方向不同外,其他表面特性(纤维直径、孔隙分布)应无统计学差异。四种支架由荷兰奈美津大学牙学院生物材料系运用其改良的静电纺丝技术进行构建并提供。通过光学显微镜、扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)观察支架的表面形态,快速傅氏变换(FFT)分析支架纤维的方向性。Image J分析支架纤维直径、表面的孔隙面积及分布。实验结果：四种支架的表面特性符合实验设计要求。1.平行支架在光学显微镜、SEM和AFM下大部分纤维呈同一方向排列,FFT像素沿一个特定方向分布。2.交叉支架在光学显微镜和SEM下纤维呈两个方向交叉排列。而由于AFM检测范围较小,交叉支架的纤维在AFM下则呈同一方向排列。FFT像素沿两个特定的方向分布。3.随机支架在光学显微镜下呈光滑平面,在SEM及AFM下则观察到其纤维在支架表面随机排列,无任何方向性。FFT像素呈一对称圆形分布,无特定方向的增强。4.光滑膜支架在光学显微镜下表面光滑透明,在SEM及AFM下未观察到纤维成分及孔隙。FFT像素无特定方向的增强。5.平行、交叉、随机支架表面纤维的平均直径和孔隙面积无统计学差异(p>0.05),孔隙面积分布也相似。结论：本实验成功获得主纤维排列具有高度一致性的有序定向支架,可模拟天然牙周膜组织微观结构,满足后续牙周组织工程研究的需要。实验二人牙周膜干细胞的培养与鉴定实验目的：采用酶消化法分离培养人牙周膜干细胞,并对其干细胞特性进行鉴定。实验材料和方法：采用I型胶原酶和dispase Ⅱ共同消化、分离培养人牙周膜干细胞。流式细胞仪检测培养细胞的干细胞表面标志物的表达(STRO-1、CD44、CD146)。同时,通过对细胞进行体外成骨、成脂肪诱导,检测其多向分化潜能。实验结果：分离培养的牙周膜细胞具有一定的克隆形成能力。流式细胞仪检测显示：该细胞的STRO-1、CD44和CD146的阳性率分别为6.54±0.5%、99±0.5%和45±1%。茜素红染色后发现,成骨诱导后的PDLSCs逐渐形成矿化结节。油红O染色后发现,成脂肪诱导后的PDLSCs逐渐形成脂滴。结论：本实验酶消化法培养的牙周膜干细胞经过鉴定表达干细胞的表面标志物,具有成骨向、成脂肪向分化潜能。实验三不同基因载体对牙周膜干细胞转染效率的比较实验目的：鉴于非病毒载体具有较好的生物安全性、低毒性等优点,本实验重点比较不同非病毒载体对PDLSCs的转染效率及毒性,旨在寻找针对PDLSCs转染效率最佳的基因载体和转染条件。实验材料和方法：在本实验中,选用慢病毒载体和五种非病毒载体转染PDLSCs,包括：两种经典的化学基础转染试剂,即Lipofectamine 2000 Reagent (Lipo)和 GBfectene-Elite transfection reagent (GB-Elite)，一种常用的阳离子聚合物,即polyethylenimine(PEI),一种针对较难转染细胞的新型转染试剂,即X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (X-tremeGENE),以及磁转染方法,即MATra Magnet Assisted Transfection (MATra)。为了寻找每种试剂最佳的转染条件,按照试剂推荐剂量的2倍(2×),1倍(1×)和0.5倍(0.5×)三种转染试剂剂量对PDLSCs进行转染。采用荧光显微镜和流式细胞仪检测不同基因载体的转染效率,同时光学显微镜下观察细胞的毒性。实验结果：在五种非病毒转染试剂中,Lipo的转染效率最低,其次为PEI,GB-Elite, X-tremeGENE,不足6%。MATra的转染效率相对较高,强阳性率为11%。而慢病毒的转染效率可达到95%。同时,细胞毒性随着转染试剂剂量的增加而增大。其中,Lipo,PEI和GB-Elite的细胞毒性强于X-tremeGENE 和MATra。根据不同剂量的转染效率及对细胞的毒性,在使用这五种试剂时,我们推荐1×的转染试剂,即产品说明的推荐剂量。结论：针对PDLSCs,MATra的转染效率在五种非病毒载体中相对较高。但是,与慢病毒相比,非病毒载体的转染效率极低。实验四 BMP2慢病毒载体构建并转染人牙周膜干细胞实验目的：前期研究发现：按照SBI System Bio science公司慢病毒包装试剂盒使用说明包装慢病毒,运用Lipofectamine 2000将四种包装质粒共转染入293T细胞时,转染效率较低。因此,本实验首先寻找BMP2慢病毒载体包装最佳的转染试剂,以优化慢病毒包装条件。采用慢病毒载体对PDLSCs进行转染,并对转染后细胞的BMP2的表达进行鉴定。实验材料和方法：运用以下五种转染试剂对慢病毒包装的工具细胞293T细胞进行转染, TurboFect Transfection Reagent、EntransterTM-D4000、NeofectTM DNA transfection reagent、Lipofectamine 2000 和 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent。荧光显微镜下观察转染效率。构建BMP2慢病毒后,对PDLSCs进行转染。在转染后3天,Q-PCR和real-time PCR检测细胞的BMP2基因表达。在转染后7天,western blot检测细胞的BMP2蛋白表达。同时,设置空载慢病毒转染PDLSCs组和未转染PDLSCs组作为对照组。实验结果：针对293T细胞,TurboFect Transfection Reagent的转染效率在五种转染试剂中最高。Q-PCR, real-time PCR和western blot结果显示：与对照组相比,BMP2/PDLSCs呈现BMP2基因和蛋白的高表达。结论：可选择TurboFect Transfection Reagent作为包装试剂进行慢病毒包装,将BMP2基因成功整合到PDLSCs,为基因治疗和组织工程的联合应用研究提供细胞基础。实验五有序定向电纺支架对BMP2/PDLSCs生物效应的影响实验目的：观察细胞在不同纤维排列支架上的生长方向和增殖。通过观察在不同纤维排列方向支架上的BMP2/PDLSCs的成骨能力,探索有序定向支架是否影响基因治疗效果。实验材料和方法：将BMP2/PDLSCs接种到四种表面纤维排列不同的支架上：两种有序支架(平行和交叉支架),两种非有序支架(随机支架和光滑膜支架)。在接种后3天,运用共聚焦显微镜和SEM观察支架上的细胞形态。PicoGreen试剂盒检测细胞在支架上的增殖情况。Real-time PCR和western blot检测支架上细胞的成骨相关基因和蛋白表达(BMP2、ALP、BSP、ColI、OCN和Runx2)。同时检测细胞在支架上的ALP活性、Ⅰ型胶原含量和钙离子含量。运用SEM观察细胞在支架表面的钙化情况。实验结果：1.BMP2/PDLSCs在有序定向支架上沿其主纤维轴生长排列,而非定向组的细胞生长则呈无序随机排列。2.与非定向支架相比,接种在有序支架上BMP2/PDLSCs的DNA含量显著增多(p<0.05)。3.有序定向组的BMP2、ALP、 BSP、Col I、 OCN、Runx2基因和蛋白的表达明显高于非有序组(p<0.05)。4.生物效应方面,有序定向支架组细胞的ALP活性、Ⅰ型胶原含量和钙离子含量明显高于非有序组(p<0.05)。同时,SEM结果显示：与非有序支架相比,有序支架表面形成更多的矿化结节。5.平行和交叉支架在上述结果中无明显差异。结论：与非定向支架相比,有序定向支架能更好的引导BMP2/PDLSCs的生长方向、促进细胞的增殖,增强BMP2/PDLSCs的成骨能力。而两种有序定向支架(平行和交叉支架)之间在引导细胞生长方向、促进增殖和增强细胞成骨能力方面并无明显差异。小结通过改良电纺技术制备的主纤维排列具有高度一致性的有序定向支架不仅可以引导细胞的生长方向、促进细胞的增殖,还可以增强BMP2/PDLSCs的成骨分化。本研究首次发现：有序定向支架不仅仅是体外基因治疗的载体,还可以显著增强体外基因治疗的效果。BMP2/PDLSCs/有序定性支架的复合体不仅具有物理支持作用,引导有序的细胞生长,模拟天然牙周组织有序微观结构方面显示出明显优势,而且具有诱导成骨能力。BMP2/PDLSCs/有序定向支架将是一种具有潜在价值的牙周组织工程复合体。